Study of the role of MID1 in tauopathies and its application as a therapeutic target

ヒトmidline-1（MID1）を恒常的に安定発現する細胞株を作製した。ヒト胎児腎細胞293（HEK293T細胞）からクローニングしたヒトmidline-1（MID1）配列をpIRESpuro3プラスミドベクターにサブクローニングした（pIRESpuro3-MID1）。また、MID1のN末端側またはC末端側に緑色蛍光タンパク質（EGFP）を融合したタンパク質（EGFP-MID1またはMID1-EGFP）を発現するためのpIRESpuro3プラスミドベクターも作製した（pIRESpuro3-EGFP-MID1またはpIRESpuro3-MID1-EGFP）。これらのプラスミドベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションし、ピューロマイシンで選択後、1細胞を単離して培養することで、クローン細胞株を得た。マウスおよびヒトの両方を認識する抗MID1抗体の選定を実施した。市販されている5つの抗体について、ウェスタンブロッティングにおける検出を指標にして検討したところ、4つがヒト細胞株（HEK293T）でMID1に相当する分子量のバンドが検出されたが、うち2つは同時に多数のバンドも検出された。一方、5つの抗体のいずれもマウス脳抽出物ではMid1に相当するバンドは検出されなかったことから、マウス脳におけるMid1を検出するためには抽出方法を検討する必要があると考える。ヒトMID1については特異的に認識する抗体２つを選定できたことから、今後はこれらの抗体を用いて、タウの病的変化におけるMID1の機能について解析を進める予定である。

ヒトmidline-1（MID1）を恒常的に安定発現する細胞株を作製した。ヒト胎児腎細胞293（HEK293T細胞）からクローニングしたヒトmidline-1（MID1）配列をpIRESpuro3プラスミドベクターにサブクローニングした（pIRESpuro3-MID1）。また、MID1のN末端側またはC末端側に緑色蛍光タンパク質（EGFP）を融合したタンパク質（EGFP-MID1またはMID1-EGFP）を発現するためのpIRESpuro3プラスミドベクターも作製した（pIRESpuro3-EGFP-MID1またはpIRESpuro3-MID1-EGFP）。これらのプラスミドベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションし、ピューロマイシンで選択後、1細胞を単離して培養することで、クローン細胞株を得た。マウスおよびヒトの両方を認識する抗MID1抗体の選定を実施した。市販されている5つの抗体について、ウェスタンブロッティングにおける検出を指標にして検討したところ、4つがヒト細胞株（HEK293T）でMID1に相当する分子量のバンドが検出されたが、うち2つは同時に多数のバンドも検出された。一方、5つの抗体のいずれもマウス脳抽出物ではMid1に相当するバンドは検出されなかったことから、マウス脳におけるMid1を検出するためには抽出方法を検討する必要があると考える。ヒトMID1については特異的に認識する抗体２つを選定できたことから、今後はこれらの抗体を用いて、タウの病的変化におけるMID1の機能について解析を進める予定である。