Basic Research for pathophysiology of RASopathy approaching from Melanocytes

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色素細胞、神経細胞の培養上清に存在するエキソソームを超遠心法により分取し、プロテオミクスの手法を用いて解析を行った。まだ条件設定に未熟な点があるが、過去に使用した実績がある、未分化細胞を用いて、胚性幹細胞のと同様の手法でメラノサイトへの分化誘導実験の試みを実施した。これらにより、明らかになったのは、メラノサイトへの分化誘導を行う段階に置いて、分化した細胞と未分化の細胞の分取や分化導入の効率の問題から６ウェルや35mm培養皿でのスケールでは解析が難しいという点である。今の実験系のような一過性ではなく、再現性の観点からも分化した細胞を継代できる細胞として樹立することが望ましいが、そのためには分化した株を効率よく分ける手法として、薬剤マーカーが必要となる。そのために導入遺伝子の再構築が必要となるため、手間取っている。マウス神経節細胞由来の細胞株におけるras（変異なし）の過剰発現株の単独培養においては、100mmの培養皿の10mLの培養液（10%牛胎児血清含有）４枚を細胞密度60％から100％になるまで培（２.5日間）の培養した培養上清から超遠心法でエキソソームを調整し、２次元電気泳動法で展開してエキソソーム中に含まれる蛋白質をスポットとして解析すると、想定していたより蛋白質のスポット数が少ないという意外な結果であった。現在は培養条件を変えて検討しているが、複数の異なる細胞との共培養によって解析をするまでには至っておらず、研究の全体として進捗が遅いのが現状である。コロナ禍でもあり、あたらしく細胞の入手に手間取っているのも研究の進展にとって影響を与えている。同時に進めている神経線維腫症１型の原因遺伝子の全長cDNAの構築と発現ベクターへの再構築については、全長が２つに分かれた状態でつなぐことができているが、全長が繋がった状態の構築には至っていない。