破骨細胞におけるシステイン・プロテアーゼ・インヒビター、シスタチンCの発現の解析

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(1)免疫光顕による破骨細胞でのシスタチンCの局在の検索。マウスを固定後、脛骨を採取した。脱灰後1μm凍結切片を作製し、抗シスタチンc抗体を用いたABC法で検索した。骨組織でのシスタチンCは破骨細胞の細胞内および破骨細胞の面する骨吸収窩に認められた。また骨芽細胞やその他の細胞にもその局在が認められた。(2)免疫電顕による破骨細胞でのシスタチンCの局在の検索。マウスを固定後、脛骨を採取した。脱灰後100μm切片を作製し、前包埋法による免疫電顕法のため、抗シスタチンC抗体を用いたABC法にて免疫染色を行い、その局在を電顕にて詳細に検索した。結果は、破骨細胞内では、粗面小胞体、ゴルジ装置、分泌顆粒、また波状縁付近の空胞内にその局在が認められた。破骨細胞外では、波状縁膜上に認められたほか、骨吸収窩では線維様構造物にも観察された。反応産物の線維様構造物上での沈着様式は規則正しい横紋を呈したため、I型コラーゲンと考えられた。InsituhybridizationやNorthernblottingでのシスタチンC遺伝子発現は明らかではないが、免疫電顕所見より、破骨細胞内でのシスタチンC合成と骨吸収窩への分泌が微細構造学的に証明できた。またこれらの免疫電顕による結果は、当教室における骨吸収関与蛋白分解酵素カテプシンKの局在(Yamaza,etal.,1998,BONE)と一致しており、破骨細胞性骨吸収における内因性蛋白分解酵素インヒビターの関与が強く示唆された。現在、1、2の結果について、学会発表の準備および英語論文作製中である。(3)アンチセンス法による破骨細胞性骨吸収におけるシスタチンCの役割。シスタチンC合成オリゴDNA(20mer)を、マウス培養破骨細胞に導入させた。しかしながら、合成オリゴDNAの導入率が悪く、十分な結果が得られていないのが現状である。現在、合成オリゴDNAの効率的な導入方法にって検討中である。