メイラード反応後期生成物の主要構造と、老化や糖尿病における生体内発現様式の解析

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高血糖に伴い多くの生体タンパク質が、非酵素的に糖付加反応(メイラード反応)を受けている。この反応は、グルコース糖の還元糖がタンパク質のリジン残基を介してシッフ塩基を形成し、アマドリ転位反応生成物に至る前期反応と、更に長期の反応を経て褐色変化、蛍光性あるいは分子間・内架橋を特徴とする後期生成物(Advanced Glycation End Protducts ; AGE)に至る後期反応から構成される。AGEが糖尿病合併症や老化現象と密接に関係することが指摘されているが、後期段階の如何なる構造体がこれらの病変発症と関係しているかなどの物質論的な情報に乏しいのが現状である。我々は、AGEの主要構造体の化学構造を決定と、その構造体の老化や糖尿病における生体内発現機構の解明を目的として実験を行い下記のような成果を得た。1、主要蛍光物質X1の単離および構造解析 最も単純なモデル化合物であるα-Tosyl-L-lysine(Tos-Lys)や種々のリジン誘導体等を用いて、グルコースとメイラード反応させ、蛍光・褐色性のAGE-Tos-Lys誘導体を調製した。逆相HPLCによって、反応時間に比例して顕著に蛍光性を増加させているピーク(主要蛍光物質AGEX1)を単離精製した。1H-,13C-NMR(COSY,HMQC,INADEQUATE)およびMass(FABMS,SIMS)スペクトルによる構造解析によって、AGEX1は2分子のグルコースが2分子のリジンのε-アミノ基を介して結合し、ピリジニウム環を形成している分子量832(AGEX1-Tos-Lysで計算した場合)の蛍光物質(4-keto-5-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-1,7-bis[6-(N-tosyl-L-norleucyl)]-1,7-naphthyridinium)であることが判明した。2、X1の免疫化学的解析 X1が生体タンパク質に発現しているかどうかを解析するために、X1-Tos-lysをカブトガニヘモシアニン(KLH)と重合させ、兎に免役することにより抗X1-KLH抗血清を得た。本血清はAGE-Tos-lys等のAGE-リジン誘導体のみならず、AGE-BSAやその他のAGEタンパク質と有意に反応したが非修飾化合物やタンパク質とは反応しなかった。更に、生体タンパク質であるヒト正常レンズタンパク質とも反応し、その反応性は加齢に比例して増加した。これらの結果より、AGE-Lys誘導体より分離した主要蛍光物質AGEX1は、AGEタンパク質上に発現するAGE共通の主要構造体の一つであり、生体タンパク質にも発現して加齢により増加していることが判明した。現在抗AGEモノクローナル抗体による解析を進めており、この構造体の糖尿病合併症や老化の病態における臨床マーカーとしての可能性を検討している。