高効率物質生産システムとしての浮遊-付着可変型動物細胞培養系の開発

开发浮动贴壁可变动物细胞培养系统作为高效物质生产系统

• 批准号: 09876023
• 负责人: 人見 清隆
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09876023/
• 关键词: 筋芽細胞; カルパスタチン; カルパイン; 付着性細胞

本年度は最終年度であり、以下の通り研究を総括する。動物細胞を用いた物質生産、機能解析を行う上で、付着細胞を何らかの制御機構の下で浮遊化して培養することができれば、非常に多彩な実験系が成立する。本研究はそのような細胞培養系の確立を最終目的として、細胞接着タンパクの切断や付着性に関与する細胞内プロテアーゼ、カルパインの発現制御を行ってそのような細胞株が作成できるか検討したものである。すなわち、カルパインとその特異的阻害タンパク質カルパスタチンについて、一方を誘導的に発現させるなど、本来厳密にレベルが制御される両タンパクの割合を変えて、接着関連タンパクの急激な変化、ひいてはその付着性の変化を検討しようとした。細胞としては、筋芽細胞C2C12、および線維芽細胞NIH3T3,L929を用いた。本研究では初年度にまず、カルパイン、カルパスタチンの安定発現株の取得を試み、カルパスタチンについてのみ成功した。カルパインについては、最終年度まで取得ができなかった。カルパスタチンについては、NIH3T3については付着性に変化が生じ、カルパイン活性の相対的な低下も見られた。逆にカルパスタチン発現量を抑制させて、カルパイン活性の相対的な上昇→付着性の現象を試みているが、抑制株の取得を現在行っている段階である。カルパスタチン、カルパインの安定、誘導発現株の取得は他の遺伝子群に比べて明らかに困難で、これは細胞に致死的効果があったためではないかと考えられる。

今年是最后一年，研究总结如下。当使用动物细胞进行物质生产和功能分析时，如果可以通过在某些控制机制下漂浮培养粘附细胞，则可以建立一个非常多样化的实验系统。这项研究研究了是否可以通过控制细胞内蛋白酶的表达来产生这种细胞系，这些细胞内蛋白酶的表达与细胞粘附蛋白的分裂和粘附有关，其最终目标是建立此类细胞培养系统。换句话说，我们试图通过更改两种蛋白质的比例来研究与粘附相关蛋白的突然变化，从而研究其与粘附相关的蛋白质的突然变化，这些蛋白质本质上严格调节，例如通过诱导其中一种蛋白质调节。细胞是成肌细胞C2C12和成纤维细胞NIH3T3和L929。在这项研究的第一年中，我们首先尝试获得稳定的表达菌株和钙蛋白酶素的表达菌株，并且只能成功使用calpastatin。直到最后一年才可用Calpain。关于钙蛋白酶蛋白，NIH3T3发生了依从性的变化，并且还观察到钙蛋白酶活性相对降低。相反，我们正在尝试抑制calpastatin的表达水平，并试图增加钙蛋白酶活性→依从性的相对增加，但目前我们正在获得抑制菌株。与其他基因组相比，很难获得稳定且可诱导的钙蛋白酶和钙蛋白酶，这可能是由于对细胞的致命作用。

项目成果

K.Hitomi: "Constant Expression of Mouse calpastatin isoforms during differentiation in myoblast cell line,C2C12"Cytotechnology. (印刷中). (2000)

K.Hitomi：“成肌细胞系分化过程中小鼠钙抑素亚型的恒定表达，C2C12”《细胞技术》（出版中）。

Takahashi et al.: "Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasior by the membrane-anchoed gycoprotein RECK" Proceedings of the National Academy of Science.USA.95. 13221-13226 (1998)

Takahashi 等人：“膜锚定糖蛋白 RECK 调节基质金属蛋白酶 9 和抑制肿瘤侵袭”美国国家科学院院刊 95。

J.Takano: "Structure of mouse calpastatin isoforms:Implication of species-common and species-specific alternative splicing"Biochemical Biophysical Research Communications. 260. 339-345 (1999)

J.Takano：“小鼠钙蛋白酶同种型的结构：物种常见和物种特异性选择性剪接的含义”生物化学生物物理研究通讯。

Edy M.Vilei, et.al.: "Functional properties of recombinant calpain I and of mutants lacking domains and of the cafalytic subunit" Journal of Biological Chemistry. 272,(41). 25802-25906 (1997)

Edy M.Vilei 等人：“重组钙蛋白酶 I 和缺乏结构域的突变体以及 cafalytic 亚基的功能特性”《生物化学杂志》。