免疫グロブリンGを有する塩濃度刺激応答性高分子によるアフィニティ沈殿法の開発

現在まで申請者が検討してきた温度のわずかな刺激に対して溶解性が可逆的に変化する可溶・不溶可逆固定化酵素の研究成果を踏まえて、塩濃度刺激応答性アフィニティ吸着体を調製し、抗体の精製に利用できる免疫特異的吸着タンパク質Protein Aの分離・精製に適用すること検討した。すなわち、精製目的物質である免疫特異的蛋白Protein Aを黄色ブドウ状細菌Staphylococcus aureusの破砕物(粗蛋白液)から直接分離・精製するために、低温かつ塩の添加によりその溶解性が可逆的に変化し、かつこの機能性高分子の側鎖にIgGのFc領域を有する塩濃度刺激応答性IgG(Fc)を新規に開発する。この吸着体の温度応答性とProtein Aに対する親和性を利用したアフィニティ沈殿法により、Protein Aを効率よく高純度に精製することを検討し、以下の成果を得た。1)低温域温度刺激応答性高分子調製用のモノマーとしてAcryloyl piperidine(APp)等を合成した。さらに、このモノマーとMethacrylate(MAA)を用いた溶液重合により高分子鎖にカルボキシル基を有する機能性高分子[Poly(APp-co-MAA)]を調製した。本高分子水溶液は、可逆的に4°C以下で可溶状態、また、8°C以上で完全に不溶状態となる性質を有していた。さらに、4°Cの条件下でNaClを50g/lになるように添加することにより完全に不溶化させることができた。2)1)で合成した温度応答性高分子に、アフィニティリガンドであるIgGのFc領域を固定化することにより、塩濃度刺激応答性IgGを調製した。本吸着体の温度および塩応答も、高分子の温度応答にほぼ等しかった。3)本吸着体をProtein Aの精製に利用した場合、pH7.0、4°Cの条件において最大吸着を示し、吸着体当たりの吸着量は・解離特性を検討する。さらに、吸着体に結合したProtein Aの解離方法について吸着量は2.5×10^<-8> mol/g-吸着体となった。さらに、目的タンパク質が吸着した吸着体は、NaClを50g/lなるように溶液に添加することによって完全に不溶化し、遠心分離により回収することができた。4)吸着体に結合したProtein Aの解離に、ジメチルアミンの添加が有効であり、0.05Mの濃度で1時間放置することにより、完全に吸着体から分離回収することができた。

現在まで申請者が検討してきた温度のわずかな刺激に対して溶解性が可逆的に変化する可溶・不溶可逆固定化酵素の研究成果を踏まえて、塩濃度刺激応答性アフィニティ吸着体を調製し、抗体の精製に利用できる免疫特異的吸着タンパク質Protein Aの分離・精製に適用すること検討した。すなわち、精製目的物質である免疫特異的蛋白Protein Aを黄色ブドウ状細菌Staphylococcus aureusの破砕物(粗蛋白液)から直接分離・精製するために、低温かつ塩の添加によりその溶解性が可逆的に変化し、かつこの機能性高分子の側鎖にIgGのFc領域を有する塩濃度刺激応答性IgG(Fc)を新規に開発する。この吸着体の温度応答性とProtein Aに対する親和性を利用したアフィニティ沈殿法により、Protein Aを効率よく高純度に精製することを検討し、以下の成果を得た。1)低温域温度刺激応答性高分子調製用のモノマーとしてAcryloyl piperidine(APp)等を合成した。さらに、このモノマーとMethacrylate(MAA)を用いた溶液重合により高分子鎖にカルボキシル基を有する機能性高分子[Poly(APp-co-MAA)]を調製した。本高分子水溶液は、可逆的に4°C以下で可溶状態、また、8°C以上で完全に不溶状態となる性質を有していた。さらに、4°Cの条件下でNaClを50g/lになるように添加することにより完全に不溶化させることができた。2)1)で合成した温度応答性高分子に、アフィニティリガンドであるIgGのFc領域を固定化することにより、塩濃度刺激応答性IgGを調製した。本吸着体の温度および塩応答も、高分子の温度応答にほぼ等しかった。3)本吸着体をProtein Aの精製に利用した場合、pH7.0、4°Cの条件において最大吸着を示し、吸着体当たりの吸着量は・解離特性を検討する。さらに、吸着体に結合したProtein Aの解離方法について吸着量は2.5×10^<-8> mol/g-吸着体となった。さらに、目的タンパク質が吸着した吸着体は、NaClを50g/lなるように溶液に添加することによって完全に不溶化し、遠心分離により回収することができた。4)吸着体に結合したProtein Aの解離に、ジメチルアミンの添加が有効であり、0.05Mの濃度で1時間放置することにより、完全に吸着体から分離回収することができた。