真核生物の遺伝的組換えの試験管内反応系の確立

真核生物基因重组体外反应体系的建立

• 批准号: 08680743
• 负责人: 篠原 彰
• 金额: --
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680743/
• 关键词: 相同組換え; 試験管内反応系; Rad51蛋白; Rad52蛋白; 出芽酵母

相同組換え反応は体細胞分裂期にはDNA二重鎖の切断の修復に必須の役割を果たす。特にDNA間の相同性を認識し、交換を行う中間過程は一連の組換え反応の中で根幹をなす反応である。出芽酵母の遺伝的解析からこの過程に少なくともRad51,-52,-54,-55,-57,-59,RPA蛋白質が関与していることが知られている。現在までに、Rad51が試験管内で大腸菌RecAの様に組換え反応を試験管内で行うことが示されている。一方、これらの遺伝子産物は複雑な相互作用を示し、ほとんどすべての蛋白質が蛋白質間相互作用で結ばれる。真核生物の相同組換え反応の分子操作を理解するにはRad51に加え、それと相互作用する他の因子の生化学的性質を理解し、試験管内の組換え反応系を構築することが重要である。既に精製法が確立されたRAD51に加え、本研究で、大腸菌でRad52の、バキュロウイルスの系でRad54,55,57の量産系を確立した。Rad52については精製し、その生化学的性質を調べた。精製したRad52蛋白質をRad51蛋白質のDNA鎖交換反応、ATP水解活性を促進した。特に、DNA鎖交換反応においては単鎖DNA結合蛋白RPAと独立で相加的に促進する。また、ある条件下ではRPAはRad51のATP水解活性を阻害するが、その阻害はRad52が存在するで解除されることがわかった。これらの結果はRad52がRad51のDNAに対する結合を強めていることを示唆している。上記で見た試験管内の反応は生体内の反応を反映しているかどうかを調べるためにrad52変異株における細胞内のRad51 foci形成について調べた。Rad51 fociは核を抗Rad51抗体で染めると検出できるドット状の核内構造体で、組換えが行われている細胞内のRad51蛋白質-DNA複合体を反映していると考えられる。実際、rad52株ではRad51 fociが検出されないことは、Rad51 foci形成にはRAD52の機能が必要であることを示し、これは上記の試験官内の解析結果とよく一致している。これらの結果より組換えにおける蛋白質複合体の段階的な複合体形成が以下のように考えられる。単鎖DNAに単鎖DNA結合蛋白質RPAが結合し、蛋白質相互作用によりRad52が呼び込まれる。さらにRad51-52間の相互作用でRad51がこのRad52-RPA-ssDNA複合体に取り込まれ、形成された4者複合体がDNA間の相同性の検索、並びに交換を行うと考えられる。このように個々の構成要素から試験管内の組換え反応系を構築し、さらにcytologicalな手法を用い生体内の反応と試験官内の反応を対応づけることでよりin vivoを反映した系で組換えの分子機構が解明できることが期待できる。

In the same group, the DNA double lock must be cut during somatic cell division In particular, the identity of DNA is recognized, and the intermediate process of DNA exchange is repeated. Rad51,-52,-54,-55,-57,-59, RPA proteins are involved in the analysis of budding yeasts. Now, Rad51 is in the test tube, and the E. coli RecA is in the test tube. One of the most important aspects of protein interaction is that it is a complex interaction between proteins. It is important to understand the molecular operation of the same component in eukaryotes and to construct a system of components in a tube for the purpose of understanding the biochemical properties of other factors in addition to Rad51 and Rad51 interactions. Since the purification method was established, the mass production system of Rad52, Rad 54, Rad 55, Rad 57 was established in this study. Rad52 is refined and biochemical in nature. Purified Rad52 protein DNA lock exchange reaction, ATP hydrolysis activity of Rad51 protein In particular, DNA lock exchange is promoted by the addition of DNA binding protein RPA. Under these conditions, RPA inhibits the ATP hydrolysis activity of Rad51 and inhibits the existence of Rad52. The result is that Rad52 binds to Rad51 DNA. In the above note, we can see that the reaction in the tube and the reaction in the body are reflected in the regulation of the Rad51 foci in the cell. Rad51 foci is a nuclear antibody against Rad51. It is a protein complex in the nucleus of cells. In fact, rad52 strain Rad51 foci is necessary for the formation of RAD52 function, and the analysis results of Rad51 foci are consistent. As a result, the protein complex was formed in the following stages: Single DNA Single DNA Binding Protein RPA Binding, Protein Interaction Rad52 The interaction between Rad 51 and Rad52 resulted in the formation of a four-member DNA complex, which was characterized by the identification of DNA identity and the exchange of DNA. In vivo, the molecular mechanism of the system is analyzed.