網膜神経細胞に発現する新しい細胞増殖因子の検索とその分子クローニング

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緑内障は網膜神経細胞の細胞死が引き金となって網膜が損傷される疾患で成人の失明原因の上位を占める重要な眼疾患である。本研究では網膜神経節細胞の細胞死を阻害する細胞増殖因子の検索を行った。網膜神経細胞を選択的に単離・培養するために、二段階パンニング法および培養条件の検討を行った。90%前後の純度で神経節細胞を濃縮するこたができた。この神経節細胞からmRNAを抽出して以下の実験を行った。神経細胞の細胞死にたいして制御効果が知られているBDNF等のneurotrophic factorについて、これら遺伝子群の発現の有無をRT-PCR法を用いて検討した。また同時にこれらの遺伝子と相同な網膜特異的発現をする新しい遺伝子の検索を行った。実験に使用したプライマーは、遺伝子群の塩基配列を比較して3系統に分類し、それぞれの系統について高い相同性を示す領域の塩基配列をもとにプライマーを剛性した。RT-PCRでは発現量の少ないものを検索するためnested primer法を用いて二段階のPCRを行い、予想される大きさのPRC産物をアガロース電気泳動によって分離・精製して、AT-クローニング・ベクターにスブクローニングした。各プライマーセットについて100個のクローンを単離し、その塩基配列を決定した。塩基配列をデータバンクと比較したところ、細胞増殖因子と相同性を有するクローンは見出せなかった。一方、最近、米国との共同研究によってレンズ上皮細胞でHepatoma-derived growth factorとアミノ末端992アミノ酸配列において67%の高い相同性を有する新しい増殖因子を発見した。この塩基配列をもとにプライマーを合成して、網膜由来のmRNAを用いてRT-PCRを行ったところ、この増殖因子が網膜でも発現していることが明らかとなった。現在はこの因子に対する抗体を作成して、免疫組織化学的検討を行っている。