piRNA and spermatogenesis on reproductive isolation

本研究は、雑種不稔マウスモデルを用い、連続する精子形成でのpiRNAを含む転写物のダイナミクスな発現様式をゲノムワイドに明らかにし、生殖隔離における雄性減数分裂停止機構の解明に挑戦することを目的としている。2022年度は、①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発と②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発、を実施した。①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発では各候補piRNAにそれぞれ対応した17種類のsgRNA発現ベクターを構築した。これらのベクターにはpiRNAに対応するsgRNAだけではなく、切断することで蛍光タンパクが発現する切断レポーターカセットも搭載した。実際に生殖細胞でゲノム編集を生じさせる前に、各sgRNAの切断活性をマウス胚性幹細胞で評価した。切断をレポートする蛍光を発現する細胞のみを分取して、それらをシングルセルクローニングし、ゲノムDNAを抽出した。それらをクローンにおける変異をPCRもしくはサンガーシークエンスで確認したところ、sgRNA間で活性に差があったものの全てのsgRNAが標的サイトに変異誘導が可能であった。②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発では、生殖細胞特異的に発現することが知られているマウス内在性遺伝子の下流に、IRESでつないだEGFP遺伝子とゲノム編集エフェクター遺伝子を受精卵ゲノム編集でノックインした。ノックインが確認されたファウンダーマウスにおいて、生殖細胞でEGFPが発現することが確認できた。

本研究は、雑種不稔マウスモデルを用い、連続する精子形成でのpiRNAを含む転写物のダイナミクスな発現様式をゲノムワイドに明らかにし、生殖隔離における雄性減数分裂停止機構の解明に挑戦することを目的としている。2022年度は、①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発と②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発、を実施した。①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発では各候補piRNAにそれぞれ対応した17種類のsgRNA発現ベクターを構築した。これらのベクターにはpiRNAに対応するsgRNAだけではなく、切断することで蛍光タンパクが発現する切断レポーターカセットも搭載した。実際に生殖細胞でゲノム編集を生じさせる前に、各sgRNAの切断活性をマウス胚性幹細胞で評価した。切断をレポートする蛍光を発現する細胞のみを分取して、それらをシングルセルクローニングし、ゲノムDNAを抽出した。それらをクローンにおける変異をPCRもしくはサンガーシークエンスで確認したところ、sgRNA間で活性に差があったものの全てのsgRNAが標的サイトに変異誘導が可能であった。②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発では、生殖細胞特異的に発現することが知られているマウス内在性遺伝子の下流に、IRESでつないだEGFP遺伝子とゲノム編集エフェクター遺伝子を受精卵ゲノム編集でノックインした。ノックインが確認されたファウンダーマウスにおいて、生殖細胞でEGFPが発現することが確認できた。