Biological functions of alternative splicing on mouse gastrulation

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本研究では我々独自の蛍光ノックインマウスを利用して、原腸胚形成における各胚葉で機能的なスプラシングバリアントの特定を目指す。本年度は、各々の胚葉を蛍光で識別可能なMIERUマウス(外胚葉マーカーとしてOtx2遺伝子にtdTomatoが、中胚葉マーカーとしてT遺伝子にTagBFPが、内胚葉マーカーとしてSox17遺伝子にEGFPがそれぞれbicistronicにノックインされている）ES細胞にCRISPR-Cas9を導入し、ある共通的な特徴をもつ遺伝子群のそれぞれに対するgRNAと組み合わせ、三胚葉が可視化可能な潜在能力を持つKO-ES細胞を12系統樹立した。なお、各系統で少なくとも2つ以上の独立したクローンが得られており、KOアレルの配列も決定している。これらのES細胞から胚盤胞補完法を用いることで、三胚葉可視化KO-原腸胚を発達させた。更に、胚葉毎異なる蛍光タンパクを利用したFACSにて胚葉特異的な細胞集団を分取した。なお、非遺伝子破壊MIERUマウスES細胞を用いたコントロール実験において、各胚葉特異的な細胞分取が成功したことをRNA-Seq解析で確認している。スモールサンプルからスプラシングバリアントを特定することが可能であると報告されたあるRNA-Seq法により、上述の三胚葉可視化KO-原腸胚から分取した胚葉特異的な細胞集団における遺伝子発現解析を実施した。これまでに6遺伝子の三胚葉可視化KO-原腸胚の遺伝子発現解析データを所得済みであり、現在はそのデータ解析を実施している。