重金属酵素・ニトリルヒドラターゼおよび重金属トランスポーターの構造機能解析

重金属酶、腈水合酶和重金属转运蛋白的结构和功能分析

• 批准号: 10129212
• 负责人: 清水 昌
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10129212/
• 关键词: コバルト; ニトリルヒドラターゼ; トランスポーター; ニトリル; アシド

鉄型二トリルヒドラターゼ(NHase)のX線結晶構造解析から、鉄のリガンドであることが判明している3つのシステイン残基に相当する(Rhodococcus rhodochrousJlの)コバルト型NHaseのαサブユニットにおける107Cys,105Cys,102Cysの機能を解析した。すなわち、これら3つのシステイン残基をアラニンに部位特異的変異法により置換することで、合計7種類の変異酵素(107,105,102,107/105,105/102,107/102,107/105/102)に対応する各遺伝子を作製した後、宿主Rhodococcus rhodochrous ATCC12674に形質転換し、発現させた。これらの変異酵素は無細胞抽出液レべルで全てNHase活性を示さなかった。SDS-PAGEによる検討の結果、4種(107,105,107/105,105/102)はNHase変異酵素を発現し、残り3種(102,107/102,107/105/102)は対応するNHaseタンパク質を産生しなかった。107,105,107/105,105/102の4種類のNHase変異酵素の性質を解析すべく、精製を試みた。無細胞抽出液の調製、硫安分画に続き、DEAE-Sephacel、Superdex200、Phenyl-SepharoseCL-4B、Mono-Qにより均一な各変異酵素標品を得、諸性質を検討した結果、いずれの変異酵素においても、野生型のH-NHaseでみられるコバルトに由来すると考えられる420nmの吸収極大はほとんど認められなかった。2アミノ酸置換の実験結果から、102Cysあるいはl07Cysのどちらかが存在すればNHaseタンパク質が生成すると言えるのに対し、1アミノ酸置換の実験結果からは、102CysがNHaseタンパク質生成に重要な残基であることが示唆された。これらの結果から、いずれのシステイン残基もNHase活性発現にとって重要であることが判明した。さらに、NHaseの反応機構として2種類のモデルを提唱した。すなわち、OH^-(あるいは金属に結合した水分子)に基質であるニトリルが接近し、続いて、OH^-(あるいはOH^-の塩基としての作用によって活性化された水分子)がニトリルの炭素原子を求核攻撃しイミド酸を生成し、最終的にアミドに変換される。

X-ray crystal structure analysis of iron-type NHase and functional analysis of iron-type NHase showed that the residues corresponding to the α-terminal residues of Rhodococcus rhodochrousJl were 107Cys,105Cys,102Cys. 7 kinds of isoenzymes (107, 105, 102, 107/105, 105/102, 107/102, 107/105/102) were produced by site-specific substitution of 3 kinds of isoenzymes residues. The activity of NHase in cell-free extract was detected. SDS-PAGE analysis showed that 4 kinds (107, 105, 107/105, 105/102) of NHase isoenzymes were detected and 3 kinds (102, 107/102, 107/105/102) of NHase isoenzymes were detected. 107, 105, 107/105, 105/102 The properties of NHase enzymes were analyzed and refined. Preparation of cell-free extract, sulfur extraction, DEAE-Sephacel, Superdex200, Phenyl-Sepharose CL-4B, Mono-Q, uniform preparation of various enzyme standards, results of various property investigations, origin of various enzymes, wild-type H-NHase, etc., and maximum absorption at 420nm. 2. The results of acid substitution are as follows: 102Cys, 107 Cys, 102Cys, 102Cys From these results, it is clear that the Sistein residues in the middle are important for the discovery of NHase activity. Today, NHase's reaction mechanism is proposed for two types of reactions. In the case of carbon atoms, the formation of nuclear attack and the final conversion of acid are carried out.

项目成果

Kobayashi,M. & Shimizu,S.: "Metalloenzyme nitrile hydratase : Structure,regulation,and application to biotechnology" Nature Biotechnol.16. 733-736 (1998)

小林，M.

Kobayashi,M.et al.: "The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis" FEBS Lett.439. 325-328 (1998)

Kobayashi,M.et al.：“酰胺酶的催化机制还涉及腈水解”FEBS Lett.439。

Kobayashi, M.et al.: "Lactone-ring-cleaving enzyme : genetic analysis, novel RNA editing, and evolutionary implications." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95. 12787-12792 (1998)

Kobayashi, M.等人：“内酯环裂解酶：遗传分析、新型 RNA 编辑和进化意义。”

Kobayashi,M.et al.: "Nitrilase catalyzes amide hydrolysis as well as nitrile hydrolysis" Biochem.Biophys.Res.Commun.253. 662-666 (1998)

Kobayashi,M.et al.：“腈水解酶催化酰胺水解以及腈水解”Biochem.Biophys.Res.Commun.253。