Molecular basis of action and pathogenesis of Clostridium difficile toxin B

点击翻译按钮获取中文摘要

Project Summary  Clostridium difficile toxin B (TcdB) is a major virulent factor responsible for diseases associated  with  C.  difficile  infection.  Our  understanding  of  TcdB  pathogenesis  remains  limited,  owing  in  large  part  to  a  lack  of  established  receptors  through  which  to  understand  the  in  vivo  targeting  and disease progression in colonic tissues. We recently carried out genome-­wide screens using  the  CRISPR-­Cas9  approach  and  identified  two  distinct  candidate  receptors:  Frizzled  family  proteins (FZDs) and chondroitin sulfate proteoglycan 4 (CSPG4). We further demonstrated that  both  FZDs  and  CSPG4  are  functional  receptors  for  TcdB,  and  each  can  mediate  binding  and  entry of TcdB independently. However, how FZDs and CSPG4 contribute to TcdB pathogenesis  in colonic tissues during C. difficile infection remains to be established. Here we propose three  aims to address this key knowledge barrier.     First, we found that FZDs and CSPG4 are differentially expressed in colonic tissues, with FZDs  mainly in the colonic epithelium and CSPG4 largely expressed in sub-­epithelial myofibroblasts.  We  thus  propose  a  novel  “two-­receptor,  two-­stage”  hypothesis  to  explain  TcdB  pathogenesis:  TcdB  first  targets  and  enter  the  colonic  epithelium  via  binding  to  FZDs.  Disruption  of  the  epithelium  allows  the  toxin  to  gain  access  to  sub-­epithelial  myofibroblasts,  where  TcdB  utilizes  CSPG4  as  an  alternative  receptor.  Aims  1  and  2  will  examine  this  hypothesis,  with  Aim  1  focusing  on  the  role  of  FZDs  for  TcdB  binding  and  entry  into  the  colonic  epithelium  during  C.  difficile infection in animal models, and Aim 2 focusing on the role of CSPG4 and myofibroblasts  in  TcdB  pathogenesis  during  C.  difficile  infection.  Furthermore,  we  also  found  that  binding  of  TcdB  to  FZDs  inhibits  Wnt  signaling,  which  is  essential  for  colonic  stem  cells.  We  thus  hypothesize  a  novel  mechanism  contributing  to  TcdB  pathogenesis:  TcdB  may  disrupt  colonic  stem cells through toxin-­receptor engagement, independent of its enzymatic activity inside cells.  Aim  3  will  test  this  hypothesis  by  examining  the  biological  consequences  and  pathological  relevance  of  Wnt  signaling  inhibition  utilizing  colonic  organoid  models  and  by  infection  experiments  in  animal  models  with  engineered  C.  difficile  that  expressing  the  receptor-­binding  domain  of  TcdB.  We  will  also  explore  the  therapeutic  benefit  of  GSK-­3  inhibitors,  which  modulate  Wnt  signaling,  for  reducing  the  damage  to  the  colonic  epithelium  by  TcdB  during  C.  difficile  infection.  Together,  these  studies  will  provide  a  molecular  understanding  of  disease  progression during C. difficile infection and potentially lead to novel therapeutic interventions.