Molecular basis of Zika-induced microcephaly

摘要 寨卡病毒（ZIKV）是对全球健康的一种新威胁，与发育中的大脑特别相关， 先天性小头畸形 ZIKV导致胎儿脑中神经元死亡的基础尚不清楚，但 这可能与ZIKV蛋白对细胞健康的影响有关。 ZIKV是编码10种蛋白质的RNA黄病毒 包括NS 2B/NS 3异二聚体，其形成参与ZIKV多肽切割的活性丝氨酸蛋白酶 转化成单个蛋白质。 在这里，我们建议研究ZIKV-CMV诱导的小头畸形的分子基础。 我们假设ZIKV 蛋白酶可用于切割神经前体细胞中的胞质宿主细胞蛋白，导致一系列细胞内蛋白质的降解。 缺陷，导致毒性。该应用程序汇集了三个经验丰富的研究小组， 关于ZIKV我们发表的工作集中在ZIKV对神经前体细胞的向性，ZIKV与神经前体细胞的相互作用，以及ZIKV与神经前体细胞的相互作用。 与免疫系统、ZIKV的小分子抑制剂以及ZIKV对神经元存活的影响。 我们还 发表于神经干细胞生物学、隐性人类遗传性小头畸形突变和黄病毒分子 病理 我们的初步数据表明，ZIKV NS 2B/NS 3错误表达可以以一种方式介导细胞死亡， 类似于ZIKV-CMV诱导的细胞死亡。 细胞死亡可以通过蛋白酶失活突变或通过抑制 通过ZIKV蛋白酶抑制剂（ZPI）增强蛋白酶活性。 蛋白质组学分析鉴定了一系列结合于 ZIKV蛋白酶，我们将其称为ZIKV蛋白酶-内切酶（ZPO），其中至少一种是ZIKV的直接切割靶标 ZIKV-NS 2B/NS 3诱导的细胞分裂，并且当失活时以类似于ZIKV-NS 2B/NS 3诱导的细胞分裂的方式导致胞质分裂阻断和细胞死亡。 死亡 本申请的目标是发现ZIKV蛋白质通过其表达的分子、细胞和遗传基础。 介导神经元细胞死亡，特别是在哺乳动物大脑皮层发育的背景下。 我们将联合收割机的质量 光谱分析，蛋白质相互作用网络，高级生物信息学，神经元培养模型，细胞分析 循环动力学和体内建模。 重要的是，我们将关注ZIKV观察到的毒性之间的差异， 蛋白质和其他序列相似的黄病毒，不介导神经元死亡，并将研究的机制， 在ZIKV暴露后对细胞死亡的特定神经元脆弱性。我们将：1]测试ZPO成分，以确定 其是ZIKV NS 2B/NS 3的直接蛋白酶靶标。 2]测试ZPO以确定ZIKV NS 2B/NS 3-κ介导的切割导致神经元死亡。 3]测试ZIKV蛋白酶的短期和长期效果 在发育中的脑上的表达，以及通过抑制ZIKV蛋白酶的拯救程度。 这些目标 实验的目的是确定ZIKV基因组的特定成分如何导致皮质发育中断， 确定ZIKV损害细胞存活的机制，以及药物是否可能使暴露于ZIKV的女性受益。 胎儿大脑发育期间的ZIKV。

Abstract    Zika  virus  (ZIKV)  represents  a  new  threat  to  global  health,  with  particular  relevance  to  the  developing  brain  and  risk  of  congenital  microcephaly.  The  basis  by  which  ZIKV  leads  to  neuronal  death  in  the  brain  of  the  fetus  is  unknown,  but  presumably  relates  to  effects  of  ZIKV  proteins  on  cellular  health.  ZIKV  is  an  RNA  Flavivirus  encoding  10  proteins  including  the  NS2B/NS3 heterodimer  that  forms an active  serine protease  involved  in  cleavage  of  the  ZIKV  polypeptide  into individual proteins.    Here  we  propose  to  study  the  molecular  basis  of  ZIKV-­induced  microcephaly.  We  hypothesize  that  the  ZIKV  protease  can  function  to  cleave  cytosolic host  cellular  proteins  in  neural  precursor  cells,  leading  to  a  range  of  cellular  defects, contributing to toxicity. This application brings together three experienced research groups with a track record of  collaboration on ZIKV. Our published work has focused on tropism of ZIKV for neural precursor cells, interaction of ZIKV  with  the  immune  system,  small  molecule  inhibitors  of  ZIKV,  and  effect  of  ZIKV  on  neuronal  survival.  We  have  also  published  on  neural  stem  cell  biology,  recessive  human  genetic  microcephaly  mutations,  and  flavivirus  molecular  pathology.  Our preliminary data  demonstrates  that ZIKV  NS2B/NS3 misexpression  can  mediate  cell death,  in  a manner  similar  to  ZIKV-­induced  cell  death.  Cell  death  can  be  abrogated  with  a  protease-­inactive  mutation  or  by  inhibition  of  protease  activity  through  ZIKV  protease  inhibitors  (ZPIs).  Proteomic  analysis  identified  a  series  of  proteins  bound  to  the  ZIKV  protease,  which  we  term  the  ZIKV  Protease-­Ome  (ZPO),  at  least  one of  which  is  a direct  cleavage  target  of  ZIKV  NS2B/NS3,  and  leads  to  blocked  cytokinesis  and  cell  death  when  inactivated,  in  a  manner  similar  to  ZIKV-­induced  cell  death.    The  goal  of  this  application  is  to  discover  the  molecular,  cellular  and  genetic  basis  by  which  ZIKV  proteins  mediate  neuronal  cell  death,  particularly  in  the  context  of  mammalian  cerebral  cortical  development.  We  combine  mass  spectrometry  analysis,  protein  interaction  networks,  advanced  bioinformatics,  neuronal  culture  models,  analysis  of  cell  cycle  dynamics,  and  in  vivo  modeling.  Importantly,  we  will  focus  on  differences  between  toxicity  observed  with  ZIKV  proteins  and  other  sequence-­similar  flaviviruses  that  do  not  mediate  neuronal  death,  and  will  study  the  mechanisms  of  the particular neuronal vulnerability to cell death following ZIKV exposure. We will: 1] Test ZPO constituents to determine  which  are  direct  protease  targets  of  ZIKV  NS2B/NS3.  2]  Test  ZPO  to  determine  mechanisms  by  which  ZIKV  NS2B/NS3-­mediated  cleavage  leads  to  neuronal  death.  3]  Test  the  short  and  long  term  effects  of  ZIKV  protease  expression  on  the  developing  brain,  and  the  degree  of  rescue  by  inhibition  of  the  ZIKV  protease.  The  goal  of  these  experiments  is  to  determine  how  specific  components  of  the  ZIKV  genome  lead  to  disrupted  cortical  development,  to  determine  mechanisms  by  which  ZIKV  impairs  cell  survival,  and  whether  medications  might  benefit  women  exposed  to  ZIKV during fetal brain development.