Molecular regulation of the AP2 clathrin adaptor complex

AP2 网格蛋白接头复合物的分子调控

• 批准号: 10393918
• 负责人: Gunther Hollopeter
• 金额: $ 0.89万
• 依托单位: CORNELL UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10393918
• 关键词: Address; Alzheimer' s Disease; Animals; Binding; Caenorhabditis elegans; Cardiovascular Diseases; Cardiovascular system; Cell membrane; Cell physiology; Cells; Cholesterol; Clathrin; Clathrin Adaptors; Complex; Data; Disease; Ear; Endocytosis; Ensure; Escape Mutant; Genetic Screening; Goals; Growth Factor; Health; Heart; Hepatitis; In Vitro; Influenza; Ligands; Malignant Neoplasms; Mediating; Medical; Membrane; Mitochondria; Molecular; Molecular Conformation; Molecular Machines; Mutagenesis; Names; Neurodegenerative Disorders; Neuromodulator; Pathologic; Phospholipids; Phosphorylation; Phosphotransferases; Physiological; Process; Protein Family; Proteins; Receptor Signaling; Recycling; Regulation; Research; Role; Scanning; Structure; Techniques; Testing; Therapeutic; Vesicle; Virus; Virus Diseases; design; enhancer-binding protein AP-2; in vivo; innovation; macromolecule; mutant; neoplastic; novel; particle; receptor binding; screening; spatiotemporal; tool

Abstract  -­  Clathrin-­mediated  endocytosis  is  the  main  port  of  entry  into  our  cells  for  medically  relevant  substances  including  cholesterol-­laden  particles  and  viruses  such  as  influenza  and  hepatitis.  By  engulfing  signaling receptors, this fundamental cellular process also tunes our sensitivity to the potentially pathological  actions  of  growth  factors  and  neuromodulators.  As  such,  understanding  how  the  underlying  endocytic  machinery is regulated promises to reveal novel mechanisms that could be harnessed to control neoplastic,  neurodegenerative,  cardiovascular,  and  viral  diseases.  At  the  heart  of  the  endocytic  process  lies  the  AP2  clathrin  adaptor  complex  which  appears  to  undergo  a  conformational  change  during  vesicle  formation  to  actively  couple  membrane  and  cargo  to  the  clathrin  coat.  Despite  the  central  role  of  AP2,  we  lack  critical  details  about  how  this  molecular  machine  is  regulated  in  vivo.  To  address  this  need,  we  have  developed  innovative tools in C. elegans that allow us to quantify AP2 activity at multiple levels and have employed deep  genetic  screens  to  identify  two  conserved  protein  families  that  appear  to  govern  AP2  conformation  and  activity.  Our  goal  is  to  illuminate  how  these  allosteric  regulators  of  the  endocytic  machinery  function  mechanistically.  Previously  it  was  thought  that  membrane  phospholipids,  cytosolic  cargo  domains,  and  phosphorylation  by  the  AP2-­associated  kinase  (AAK1)  activate  AP2.  Our  preliminary  data  indicate  that  a  conserved region of the membrane-­associated Fer/Cip4 Homology Domain-­only (FCHo) proteins is required  to promote endocytosis by converting AP2 to an active complex. We have named this functionally important  domain the AP2 Activator, or APA. In Aim 1 we will test whether the APA is sufficient to induce a structural  rearrangement of AP2, as well as defining the roles of membrane, cargo, and phosphorylation in that process.  We  will  determine  where  the  APA  binds  to  AP2  by  screening  for  C.  elegans  mutants  that  escape  an  APA  anchored  to  mitochondria.  We  will  evaluate  the  physiological  significance  of  AP2  phosphorylation  by  characterizing  kinase  mutants.  In  Aim  2  we  will  validate  our  hypothesis  that  adaptiN-­Ear-­Binding  Coat-­ Associated Proteins (NECAP)s counteract the active (open) conformation of AP2 to ensure proper recycling  of  adaptor  complexes.  We  have  discovered  that  AP2  accumulates  in  a  hyper-­open,  hyper-­phosphorylated  state  in  NECAP  mutants,  and  that  NECAPs  specifically  bind  open,  phosphorylated  forms  of  AP2.  We  will  determine how NECAPs regulate AP2 activity and where they function within the hierarchy of AP2 modulation  using  in  vitro  and  in  vivo  approaches.  To  fully  understand  how  NECAPs  function,  we  will  determine  their  structure, and use an innovative random-­scanning mutagenesis technique to determine the relevant NECAP-­ AP2 contacts in vivo. The long-­term impact of the proposed research will be to clarify how fundamental cellular  machinery is controlled with spatiotemporal precision in metazoans – where misregulation leads to important  diseases.

摘要：网格蛋白介导的内吞作用是进入我们细胞的主要端口， 包括胆固醇颗粒和病毒，如流感和肝炎。通过吞噬 信号受体，这一基本的细胞过程也调整了我们对潜在的病理变化的敏感性。 生长因子和神经调质的作用。因此，了解潜在的内吞作用是如何发生的， 机器被调节有望揭示新的机制，可以利用这些机制来控制肿瘤， 内吞过程的核心是AP 2， 网格蛋白接头复合物，其在囊泡形成期间似乎经历构象变化， 尽管AP 2起着核心作用，但我们缺乏关键的 关于这种分子机器如何在体内调节的详细信息。为了满足这一需求，我们开发了 在秀丽隐杆线虫中的创新工具，使我们能够在多个水平上量化AP 2活性，并采用了深入的 遗传筛选，以确定两个保守的蛋白质家族，似乎支配AP 2构象， 我们的目标是阐明这些内吞机制的变构调节剂是如何发挥作用的 以前认为，膜磷脂、胞质货物结构域和 AP 2-激酶相关激酶（AAK 1）的磷酸化激活AP 2。我们的初步数据表明， 需要膜结合Fer/Cip 4同源结构域（FCHo）蛋白的保守区 通过将AP 2转化为活性复合物来促进内吞作用。 在目的1中，我们将测试阿帕是否足以诱导结构性的 AP 2的重排，以及定义膜，货物和磷酸化在该过程中的作用。 我们将通过筛选逃避阿帕的秀丽隐杆线虫突变体来确定阿帕与AP 2结合的位置 我们将评估AP 2磷酸化的生理意义， 在目标2中，我们将验证我们的假设，即adaptiN-Ear-Binding Coat-Binding 相关蛋白（NECAP）抵消AP 2的活性（开放）构象，以确保适当的再循环 我们已经发现AP 2在一个高度开放的，高度磷酸化的 在NECAP突变体中表达，且NECAP特异性结合开放磷酸化形式AP 2。我们将 确定NECAP如何调节AP 2活性以及它们在AP 2调节层次结构中的作用 使用体外和体内方法。为了充分了解NECAP的功能， 结构，并使用一种创新的随机扫描诱变技术，以确定相关的NECAP-ESTs 拟议的研究的长期影响将是阐明细胞的基本功能， 在后生动物中，机械是以时空精度控制的-其中失调导致重要的 疾病