Molecular regulation of the AP2 clathrin adaptor complex

AP2 网格蛋白接头复合物的分子调控

• 批准号: 10393918
• 负责人: Gunther Hollopeter
• 金额: $ 0.89万
• 依托单位: CORNELL UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10393918
• 关键词: Address; Alzheimer' s Disease; Animals; Binding; Caenorhabditis elegans; Cardiovascular Diseases; Cardiovascular system; Cell membrane; Cell physiology; Cells; Cholesterol; Clathrin; Clathrin Adaptors; Complex; Data; Disease; Ear; Endocytosis; Ensure; Escape Mutant; Genetic Screening; Goals; Growth Factor; Health; Heart; Hepatitis; In Vitro; Influenza; Ligands; Malignant Neoplasms; Mediating; Medical; Membrane; Mitochondria; Molecular; Molecular Conformation; Molecular Machines; Mutagenesis; Names; Neurodegenerative Disorders; Neuromodulator; Pathologic; Phospholipids; Phosphorylation; Phosphotransferases; Physiological; Process; Protein Family; Proteins; Receptor Signaling; Recycling; Regulation; Research; Role; Scanning; Structure; Techniques; Testing; Therapeutic; Vesicle; Virus; Virus Diseases; design; enhancer-binding protein AP-2; in vivo; innovation; macromolecule; mutant; neoplastic; novel; particle; receptor binding; screening; spatiotemporal; tool

Abstract  -­  Clathrin-­mediated  endocytosis  is  the  main  port  of  entry  into  our  cells  for  medically  relevant  substances  including  cholesterol-­laden  particles  and  viruses  such  as  influenza  and  hepatitis.  By  engulfing  signaling receptors, this fundamental cellular process also tunes our sensitivity to the potentially pathological  actions  of  growth  factors  and  neuromodulators.  As  such,  understanding  how  the  underlying  endocytic  machinery is regulated promises to reveal novel mechanisms that could be harnessed to control neoplastic,  neurodegenerative,  cardiovascular,  and  viral  diseases.  At  the  heart  of  the  endocytic  process  lies  the  AP2  clathrin  adaptor  complex  which  appears  to  undergo  a  conformational  change  during  vesicle  formation  to  actively  couple  membrane  and  cargo  to  the  clathrin  coat.  Despite  the  central  role  of  AP2,  we  lack  critical  details  about  how  this  molecular  machine  is  regulated  in  vivo.  To  address  this  need,  we  have  developed  innovative tools in C. elegans that allow us to quantify AP2 activity at multiple levels and have employed deep  genetic  screens  to  identify  two  conserved  protein  families  that  appear  to  govern  AP2  conformation  and  activity.  Our  goal  is  to  illuminate  how  these  allosteric  regulators  of  the  endocytic  machinery  function  mechanistically.  Previously  it  was  thought  that  membrane  phospholipids,  cytosolic  cargo  domains,  and  phosphorylation  by  the  AP2-­associated  kinase  (AAK1)  activate  AP2.  Our  preliminary  data  indicate  that  a  conserved region of the membrane-­associated Fer/Cip4 Homology Domain-­only (FCHo) proteins is required  to promote endocytosis by converting AP2 to an active complex. We have named this functionally important  domain the AP2 Activator, or APA. In Aim 1 we will test whether the APA is sufficient to induce a structural  rearrangement of AP2, as well as defining the roles of membrane, cargo, and phosphorylation in that process.  We  will  determine  where  the  APA  binds  to  AP2  by  screening  for  C.  elegans  mutants  that  escape  an  APA  anchored  to  mitochondria.  We  will  evaluate  the  physiological  significance  of  AP2  phosphorylation  by  characterizing  kinase  mutants.  In  Aim  2  we  will  validate  our  hypothesis  that  adaptiN-­Ear-­Binding  Coat-­ Associated Proteins (NECAP)s counteract the active (open) conformation of AP2 to ensure proper recycling  of  adaptor  complexes.  We  have  discovered  that  AP2  accumulates  in  a  hyper-­open,  hyper-­phosphorylated  state  in  NECAP  mutants,  and  that  NECAPs  specifically  bind  open,  phosphorylated  forms  of  AP2.  We  will  determine how NECAPs regulate AP2 activity and where they function within the hierarchy of AP2 modulation  using  in  vitro  and  in  vivo  approaches.  To  fully  understand  how  NECAPs  function,  we  will  determine  their  structure, and use an innovative random-­scanning mutagenesis technique to determine the relevant NECAP-­ AP2 contacts in vivo. The long-­term impact of the proposed research will be to clarify how fundamental cellular  machinery is controlled with spatiotemporal precision in metazoans – where misregulation leads to important  diseases.

摘要 - 网格蛋白介导的内吞作用是进入我们细胞进行医学相关的主要端口  物质，包括富含胆固醇的颗粒和病毒，例如流感和肝炎。  通过吞没  信号受体，这个基本的细胞过程也调整我们对潜在病理的敏感性  生长因子和神经调节剂的作用。  因此，了解潜在的内吞作用是如何进行的  机械受到监管，有望揭示可用于控制肿瘤的新颖机制，  神经退行性疾病、心血管疾病和病毒性疾病。  AP2 是内吞过程的核心  网格蛋白接头复合物似乎在囊泡形成过程中经历构象变化  主动将膜和货物耦合到网格蛋白涂层上。  尽管 AP2 发挥着核心作用，但我们缺乏关键的  有关该分子机器在体内如何调节的详细信息。  为了满足这一需求，我们开发了  线虫中的创新工具使我们能够在多个水平上量化 AP2 活性，并深入使用  遗传筛选以鉴定两个似乎控制 AP2 构象的保守蛋白质家族  活动。  我们的目标是阐明这些内吞机制的变构调节剂如何发挥作用  机械地。  以前人们认为膜磷脂、胞质货物结构域和  AP2 相关激酶 (AAK1) 的磷酸化可激活 AP2。  我们的初步数据表明  需要膜相关 Fer/Cip4 同源域 (FCHo) 蛋白的保守区域  通过将 AP2 转化为活性复合物来促进内吞作用。 我们将其命名为“功能重要”  AP2 激活器或 APA 域。 在目标 1 中，我们将测试 APA 是否足以引发结构性的  AP2 的重排，以及定义膜、货物和磷酸化在此过程中的作用。  我们将通过筛选逃避 APA 的线虫突变体来确定 APA 与 AP2 结合的位置  锚定于线粒体。  我们将通过以下方式评估 AP2 磷酸化的生理意义  表征激酶突变体。  在目标 2 中，我们将验证我们的假设，即采用扎耳外套 - 相关蛋白 (NECAP) 抵消 AP2 的活性（开放）构象，以确保适当的回收  接头复合物。  我们发现 AP2 在超开放、超磷酸化的区域中积累  NECAP 突变体中的状态，并且 NECAP 特异性结合开放的磷酸化形式的 AP2。  我们将  确定 NECAP 如何调节 AP2 活性以及它们在 AP2 调节层次结构中发挥作用的位置  使用体外和体内方法。  为了充分了解 NECAP 的运作方式，我们将确定它们的  结构，并使用创新的随机扫描诱变技术来确定相关的 NECAP- AP2 体内接触。 拟议研究的长期影响将是阐明细胞的基本原理  后生动物中的机器是通过时空精确控制的——调节不当会导致重要的后果  疾病。