Molecular regulation of the AP2 clathrin adaptor complex

点击翻译按钮获取中文摘要

Abstract    Clathrin-­mediated  endocytosis  is  the  main  port  of  entry  into  our  cells  for  medically  relevant  substances  including  cholesterol-­laden  particles  and  viruses  such  as  influenza  and  hepatitis.  By  engulfing  signaling receptors, this fundamental cellular process also tunes our sensitivity to the potentially pathological  actions  of  growth  factors  and  neuromodulators.  As  such,  understanding  how  the  underlying  endocytic  machinery is regulated promises to reveal novel mechanisms that could be harnessed to control neoplastic,  neurodegenerative,  cardiovascular,  and  viral  diseases.  At  the  heart  of  the  endocytic  process  lies  the  AP2  clathrin  adaptor  complex  which  appears  to  undergo  a  conformational  change  during  vesicle  formation  to  actively  couple  membrane  and  cargo  to  the  clathrin  coat.  Despite  the  central  role  of  AP2,  we  lack  critical  details about how this molecular machine is regulated in vivo and how this regulation influences multicellular  systems.  To  address  this  need,  we  have  developed  innovative  tools  in  C.  elegans  that  allow  us  to  quantify  AP2 activity at multiple levels and have employed deep genetic screens to identify three conserved protein  families  that  appear  to  govern  AP2  conformation  and  activity.  Our  goal  is  to  illuminate  how  these  allosteric  regulators of the endocytic machinery function mechanistically. In Aim 1 we will validate our hypothesis that  adaptiN-­Ear-­Binding Coat-­Associated Proteins (NECAP)s counteract the active (open) conformation of AP2  to  ensure  proper  recycling  of  adaptor  complexes.  We  have  discovered  that  AP2  accumulates  in  an  active  state in NECAP mutants, and that NECAPs specifically bind open, phosphorylated forms of AP2. Using cryo-­ EM we have determined that the phosphorylated AP2 core bound to NECAP is conformationally inactive. We  will validate this structure in vivo and whether it reflects the end product of NECAP activity. Previously it was  thought that membrane phospholipids, cytosolic cargo domains, and phosphorylation by the AP2-­associated  kinase  (AAK1)  activate  AP2.  Our  preliminary  data  indicate  that  a  conserved  region  of  the  membrane-­ associated  Fer/Cip4  Homology  Domain-­only  (FCHo)  proteins  is  required  to  promote  endocytosis  by  converting AP2 to an active complex. We have named this functionally important domain the AP2 Activator,  or  APA.  In  Aim 2  we  will  determine  where  the  APA  binds AP2  using  cryo-­EM  and test  whether  the  APA  is  sufficient to induce a structural rearrangement of AP2, as well as defining the roles of membrane, cargo, and  phosphorylation  in  that  process.  We  will  evaluate  the  physiological  significance  of  AP2  phosphorylation  by  characterizing kinase mutants. In our new Aim 3 we will examine how membrane trafficking influences tissue  physiology using our suite of assays to study a novel mutant in a tissue patterning inversin/nephronophthisis-­ 2 protein called MLT-­4 that phenocopies loss of AP2 activity. The long-­term impact of the proposed research  will be to clarify how fundamental cellular machinery is controlled with spatiotemporal precision in metazoans,  where misregulation leads to important diseases.