Molecular regulation of the AP2 clathrin adaptor complex

摘要 网格蛋白介导的内吞作用是进入我们细胞的主要端口， 包括胆固醇颗粒和病毒，如流感和肝炎。 通过吞噬 信号受体，这一基本的细胞过程也调整了我们对潜在的病理变化的敏感性。 生长因子和神经调质的作用。 因此，了解潜在的内吞是如何 机器被调节有望揭示新的机制，可以利用这些机制来控制肿瘤， 神经变性、心血管和病毒性疾病。 内吞过程的核心是AP 2 网格蛋白接头复合物，其在囊泡形成期间似乎经历构象变化， 主动将膜和货物偶联到网格蛋白外套上。 尽管AP 2发挥着核心作用，但我们缺乏关键的 关于这种分子机器如何在体内调节以及这种调节如何影响多细胞的细节。 系统. 为了满足这一需求，我们开发了C语言的创新工具。 让我们能够量化 AP 2活性在多个水平，并采用了深入的遗传筛选，以确定三个保守的蛋白质 家族似乎支配AP 2构象和活性。 我们的目标是阐明这些变构 内吞机制的调节器以机械方式起作用。在目标1中，我们将验证我们的假设， adaptiN-Ear-Binding Coat-Associated Proteins（NECAP）s抵消AP 2的活性（开放）构象， 以确保接头复合物的适当再循环。 我们已经发现，AP 2在一个活跃的细胞中积累， 在NECAP突变体中表达，且NECAP特异性结合AP 2开放磷酸化形式。使用低温冷冻 EM我们已经确定，磷酸化的AP 2核心结合NECAP是构象失活。我们 将在体内验证这种结构，以及它是否反映了NECAP活性的最终产物。先前报告为 我认为，膜磷脂、胞质货物结构域和AP 2-β相关的磷酸化， 激酶（AAK 1）激活AP 2。 我们的初步数据表明，一个保守的区域的膜-蛋白酶， 相关的Fer/Cip 4同源结构域-单核苷酸（FCHo）蛋白是促进内吞作用所必需的， 将AP 2转化为活性复合物。我们将这个功能重要的结构域命名为AP 2激活剂， 或者阿帕 在目标2中，我们将使用冷冻电镜确定阿帕结合AP 2的位置，并测试阿帕是否 足以诱导AP 2的结构重排，以及定义膜、货物和 在这个过程中的磷酸化。 我们将评估AP 2磷酸化的生理意义， 表征激酶突变体。在我们的新目标3中，我们将研究膜运输如何影响组织 生理学使用我们的一套测定来研究组织模式倒位/肾单位营养不良中的新突变体 2蛋白称为MLT-144，表型模仿AP 2活性的丧失。拟议研究的长期影响 将阐明在后生动物中，基本的细胞机制是如何被时空精确控制的， 在那里，失调会导致严重的疾病。

Abstract    Clathrin-­mediated  endocytosis  is  the  main  port  of  entry  into  our  cells  for  medically  relevant  substances  including  cholesterol-­laden  particles  and  viruses  such  as  influenza  and  hepatitis.  By  engulfing  signaling receptors, this fundamental cellular process also tunes our sensitivity to the potentially pathological  actions  of  growth  factors  and  neuromodulators.  As  such,  understanding  how  the  underlying  endocytic  machinery is regulated promises to reveal novel mechanisms that could be harnessed to control neoplastic,  neurodegenerative,  cardiovascular,  and  viral  diseases.  At  the  heart  of  the  endocytic  process  lies  the  AP2  clathrin  adaptor  complex  which  appears  to  undergo  a  conformational  change  during  vesicle  formation  to  actively  couple  membrane  and  cargo  to  the  clathrin  coat.  Despite  the  central  role  of  AP2,  we  lack  critical  details about how this molecular machine is regulated in vivo and how this regulation influences multicellular  systems.  To  address  this  need,  we  have  developed  innovative  tools  in  C.  elegans  that  allow  us  to  quantify  AP2 activity at multiple levels and have employed deep genetic screens to identify three conserved protein  families  that  appear  to  govern  AP2  conformation  and  activity.  Our  goal  is  to  illuminate  how  these  allosteric  regulators of the endocytic machinery function mechanistically. In Aim 1 we will validate our hypothesis that  adaptiN-­Ear-­Binding Coat-­Associated Proteins (NECAP)s counteract the active (open) conformation of AP2  to  ensure  proper  recycling  of  adaptor  complexes.  We  have  discovered  that  AP2  accumulates  in  an  active  state in NECAP mutants, and that NECAPs specifically bind open, phosphorylated forms of AP2. Using cryo-­ EM we have determined that the phosphorylated AP2 core bound to NECAP is conformationally inactive. We  will validate this structure in vivo and whether it reflects the end product of NECAP activity. Previously it was  thought that membrane phospholipids, cytosolic cargo domains, and phosphorylation by the AP2-­associated  kinase  (AAK1)  activate  AP2.  Our  preliminary  data  indicate  that  a  conserved  region  of  the  membrane-­ associated  Fer/Cip4  Homology  Domain-­only  (FCHo)  proteins  is  required  to  promote  endocytosis  by  converting AP2 to an active complex. We have named this functionally important domain the AP2 Activator,  or  APA.  In  Aim 2  we  will  determine  where  the  APA  binds AP2  using  cryo-­EM  and test  whether  the  APA  is  sufficient to induce a structural rearrangement of AP2, as well as defining the roles of membrane, cargo, and  phosphorylation  in  that  process.  We  will  evaluate  the  physiological  significance  of  AP2  phosphorylation  by  characterizing kinase mutants. In our new Aim 3 we will examine how membrane trafficking influences tissue  physiology using our suite of assays to study a novel mutant in a tissue patterning inversin/nephronophthisis-­ 2 protein called MLT-­4 that phenocopies loss of AP2 activity. The long-­term impact of the proposed research  will be to clarify how fundamental cellular machinery is controlled with spatiotemporal precision in metazoans,  where misregulation leads to important diseases.