STEADY STATE FOLDING INTERMEDIATES OF LYSOZYME WITH FOURIER TRANSFORM IR SPECT
用傅里叶变换红外光谱研究溶菌酶的稳态折叠中间体
基本信息
- 批准号:6120363
- 负责人:
- 金额:--
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:1998
- 资助国家:美国
- 起止时间:1998-09-30 至 1999-08-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
Using synchrotron FTIR, we will examine the secondary structure of
lysozyme during the folding process on a sub-millisecond time scale.
Lysozyme can be unfolded chemically and refolded by diluting out the
denaturant. During folding, this enzyme displays very complex changes
in secondary structure with time. With stopped flow UV-CD
measurements three kinetic phases were detected. First, the burst
phase occurred within the first two milliseconds, at which time the
secondary structure, as measured by the UV-CD, reached a level similar
to that of the native enzyme. Quite remarkably, the secondary
structure continued to develop and at 80 ms reached a level 50%
greater than that of the native enzyme! The ellipticity then returned
Hto the native value with a time constant of about 300 ms. With the
Hinfrared measurements we expect to be able to follow this complete
Hprocess but get more information about the specific folding motifs
Hfrom the more sensitive infrared technique. The deconvolution of the
HAmide I band (1600 - 1700 cm-1), provides details of the percent of
Hthe protein structure that is ?-helical, ?-sheet, ?-turn, or extended
Hcoil. In our experiments, lysozyme is unfolded with pH and refolded
Hby adding salt (KCl). Before examining the folding intermediates in
a Htime-resolved fashion with the rapid-mixer (see Subproject 34),
first Hwe are determining the equilibrium folding and unfolding
conditions. HWe are combining circular dichroism, fluorescence, and
infrared Hspectroscopies to confirm the endpoints of the reaction.
使用同步辐射FTIR,我们将研究
在亚毫秒的时间尺度上折叠过程中的溶菌酶。
溶菌酶可以通过化学方法解折叠,并通过稀释
变性剂 在折叠过程中,这种酶表现出非常复杂的变化
二级结构的变化 停止流动UV-CD
测量检测到三个动力学阶段。 第一,爆发
阶段发生在前两毫秒内,此时,
二级结构,如通过UV-CD测量的,达到类似于
与天然酶相比。 非常值得注意的是,
结构继续发展,并在80毫秒达到50%的水平
比天然酶更强! 椭圆度又回来了
Hto本地值,时间常数约为300 ms。
红外测量,我们希望能够遵循这一完整的
Hprocess,但获得更多关于特定折叠基序的信息
从更灵敏的红外线技术。 的去卷积
HAmide I带(1600 - 1700 cm-1),提供了
蛋白质结构是什么?-螺旋形,?-床单,?-旋转或延伸
Hcoil 在我们的实验中,溶菌酶随着pH值的变化而展开,
通过加盐(KCl)。 在检查折叠中间体之前,
采用快速混合器的H时间分辨方式(见子项目34),
首先,我们确定平衡折叠和展开
条件 我们将圆二色性、荧光性和
通过红外光谱确定反应终点。
项目成果
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