RNA BIOSYNTHESIS IN ESCHERICHIA COLI
大肠杆菌中的 RNA 生物合成
基本信息
- 批准号:6329742
- 负责人:
- 金额:$ 30.68万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:1993
- 资助国家:美国
- 起止时间:1993-06-01 至 2002-11-30
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:DNA directed RNA polymerase Escherichia coli RNA active sites affinity labeling autoradiography bacterial genetics chromosome translocation crosslink enzyme activity gene expression genetic mapping genetic promoter element genetic transcription high performance liquid chromatography immobilized enzymes nucleic acid biosynthesis nucleic acid hybridization nucleic acid probes protein structure function radiotracer rifamycins transcription factor
项目摘要
DESCRIPTION: The primary focus of the research will be on three very
important features of prokaryotic transcription elongation: (i)
processivity; (ii) the relationship between RNAP movement and nucleotide
addition; (iii) fidelity and error correction. The work will be based on a
new model for elongation recently proposed by Dr. Goldfarb, which
constitutes a revision to the previously held "inchworm" model. The main
idea will be to use chemical crosslinking and protein chemistry to define
the contacts made by different functional components or RNAP, including the
front-end DNA binding site (DBS), the catalytic active center (AC), the
RNA-DNA hybrid binding site (HBS), and the upstream RNA product binding site
(RBS). In addition, the investigator proposes to dissect the basic
nucleotide addition reaction into pre- and post-translocation states.
During the past five years, a number of innovative techniques have been
developed, primarily in the Goldfarb laboratory, which provide sophisticated
tools for the investigation of structure-function relationships in
elongation: (i) RNAP walking experiments are be done with His-tagged enzyme
chelated to Ni-agarose beads, thus permitting the isolation of defined
complexes at each step. (ii) Crosslinking probes can be incorporated into
RNA at the 5' and 3' ends or within the body of the transcript, as well as
in any position on the DNA template. These can then be used to demonstrate
which parts of RNAP are contacted by the tagged nucleotide, and have also
been used to demonstrate the formation and extent of the nascent RNA-DNA
hybrid. (iii) Derivatized crosslinkable rifampicin compounds have been used
to identify the relationship between the rif binding site and the
transcription startsite. (iv) Fe++ -induced cleavage has helped identify
sites in the enzyme that make up the active center (AC). A number of these
methods have been used to characterize the active center, which appears to
be made up of modules coming from distinct regions of both beta and beta'.
The basic design of the proposed experiments will be to use specific
radioactive crosslinking agents substituted at particular positions in the
nascent RNA or in the DNA template, followed by cleavage of the crosslinked
protein subunit with any of several different amino acid-specific cleavage
reagents. Various crosslinkers with different crosslinking radii, or with
the ability to be placed at different positions in nascent RNA, will be
employed Many of these have been developed in the investigator's laboratory,
or in collaboration with a Russian research group. Analysis of the
crosslinked peptides will show which regions of the subunits are in contact
with RNA or DNA at particular stages of the transcription cycle. Mapping
will also be facilitated by introduction of histidine tags into beta and
beta', substitution of methionines at well defined, non-essential sites to
facilitate mapping with cyanogen bromide, and cleavage of beta and beta'
split into sub-domains prior to mapping.
描述:研究的主要重点将放在三个非常
原核转录延伸的重要特征:(i)
持续合成能力;(ii)RNAP运动和核苷酸之间的关系
加法;(iii)保真度和纠错。 这项工作将基于一个
Goldfarb博士最近提出的一种新的伸长模型,
构成对先前持有的“尺蠖”模型的修订。 主要
想法将是使用化学交联和蛋白质化学来定义
由不同功能组件或RNAP形成的接触,包括
前端DNA结合位点(DBS)、催化活性中心(AC)、
RNA-DNA杂交结合位点(HBS)和上游RNA产物结合位点
(RBS). 此外,研究人员建议剖析基本的
将核苷酸加成反应转化为易位前和易位后状态。
在过去的五年里,一些创新技术已经被
主要是在Goldfarb实验室开发的,
研究结构-功能关系的工具,
延伸:(i)RNAP步行实验用His标记的酶进行
螯合到Ni-琼脂糖珠,从而允许分离限定的
每一步都是复杂的。 (ii)交联探针可以并入到
在转录物的5'和3'末端或体内的RNA,以及
DNA模板上的任何位置。 这些可以用来证明
RNAP的哪些部分与标记的核苷酸接触,并且还具有
已经被用来证明新生RNA-DNA的形成和程度,
杂种 (iii)衍生的可交联利福平化合物已被用于
为了鉴定RIF结合位点和
转录起始位置。 (iv)Fe++诱导的分裂有助于确定
酶中的活性中心(AC)。 其中一些
已使用方法来表征活性中心,这似乎
由来自β和β '的不同区域的模块组成。
拟议实验的基本设计将使用特定的
放射性交联剂在特定位置取代,
新生RNA或DNA模板中,然后裂解交联的
具有几种不同氨基酸特异性切割的蛋白质亚单位
试剂 具有不同交联半径的各种交联剂,或具有
在新生RNA中被放置在不同位置的能力,
其中许多是在研究人员的实验室中开发的,
或与俄罗斯研究小组合作。 分析
交联的肽将显示亚基的哪些区域是接触的
与RNA或DNA在转录周期的特定阶段。 映射
也将通过将组氨酸标签引入β和
β ',在明确定义的非必需位点取代甲硫氨酸,
便于用溴化氰作图,以及β和β '的切割
在映射之前分成子域。
项目成果
期刊论文数量(23)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Strategies and methods of cross-linking of RNA polymerase active center.
RNA聚合酶活性中心交联的策略和方法。
- DOI:10.1016/s0076-6879(03)71014-3
- 发表时间:2003
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Mustaev,Arkadv;Zaychikov,Eugeny;Grachev,Mikhail;Kozlov,Maxim;Severinov,Konstantin;Epshtein,Vitaly;Korzheva,Nataliya;Bereshchenko,Oxana;Markovtsov,Vadim;Lukhtanov,Eugeny;Tsarev,Igor;Maximova,Tatyana;Kashlev,Mikhail;Bass,Irina;Ni
- 通讯作者:Ni
Topology of the product binding site in RNA polymerase revealed by transcript slippage at the phage lambda PL promoter.
通过噬菌体 lambda PL 启动子处的转录本滑动揭示了 RNA 聚合酶中产物结合位点的拓扑结构。
- DOI:
- 发表时间:1994
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Severinov,K;Goldfarb,A
- 通讯作者:Goldfarb,A
Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex.
转录延伸复合物活性中心的蛋白质-RNA 相互作用。
- DOI:10.1073/pnas.93.8.3221
- 发表时间:1996
- 期刊:
- 影响因子:11.1
- 作者:Markovtsov,V;Mustaev,A;Goldfarb,A
- 通讯作者:Goldfarb,A
Topology of the RNA polymerase active center probed by chimeric rifampicin-nucleotide compounds.
通过嵌合利福平-核苷酸化合物探测 RNA 聚合酶活性中心的拓扑结构。
- DOI:10.1073/pnas.91.25.12036
- 发表时间:1994
- 期刊:
- 影响因子:11.1
- 作者:Mustaev,A;Zaychikov,E;Severinov,K;Kashlev,M;Polyakov,A;Nikiforov,V;Goldfarb,A
- 通讯作者:Goldfarb,A
ATP cross-linked to Escherichia coli single-strand DNA-binding protein can be utilized by the catalytic center of primase as initiating nucleotide for primer RNA synthesis on phage G4oric template.
与大肠杆菌单链 DNA 结合蛋白交联的 ATP 可以被引物酶的催化中心用作在噬菌体 G4oric 模板上合成引物 RNA 的起始核苷酸。
- DOI:10.1021/bi972455f
- 发表时间:1998
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Godson,GN;Mustaev,AA;Sun,W
- 通讯作者:Sun,W
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