Genotoxicity and Repair of Tobacco-Specific Nitrosamine DNA Adducts

烟草特异性亚硝胺 DNA 加合物的基因毒性和修复

• 批准号: 9759921
• 负责人: Thomas E Spratt
• 金额: $ 33.58万
• 依托单位: PENNSYLVANIA STATE UNIV HERSHEY MED CTR
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2012-07-20 至 2023-05-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9759921
• 关键词: Active Sites; Binding Sites; Biological Assay; Biology; Bypass; Carcinogens; Cell Cycle; Cell Survival; Cells; Cellular biology; Chemicals; Chemistry; DNA; DNA Adducts; DNA Crosslinking Agent; DNA Damage; DNA Repair; DNA Sequence; DNA biosynthesis; DNA replication fork; DNA-Directed DNA Polymerase; Databases; Deoxyguanosine; Eukaryotic Cell; Fiber; Flow Cytometry; Fluorescence Microscopy; Genome; Genomics; Goals; Guanosine Triphosphate; In Vitro; Individual; Kinetics; Knowledge; Location; Malignant Neoplasms; Measures; Methodology; Methods; Nitrosamines; Nuclear; Nucleotide Excision Repair; Nucleotides; Organ; Play; Polymerase; Positioning Attribute; Predisposition; Process; Proteins; Regulation; Research Personnel; Risk; Role; S Phase; Scientist; Specificity; Techniques; Technology; Testing; Time; Tobacco; Tobacco-Related Carcinoma; adduct; analog; chemotherapeutic agent; crosslink; deoxyguanosine triphosphate; design; experimental study; fluorophore; genotoxicity; innovation; mutant; next generation sequencing; prevent; protein protein interaction; public health relevance; repaired; response; tool

Project Summary  Translesion DNA synthesis (TLS) polymerases are critical to cell survival by replacing high fidelity polymerases  during roadblocks that occur during DNA repair and replication. One difficulty in elucidating the multiple roles of  these polymerases is that it is impossible to identify which polymerase is active in a specific situation.  Here we  propose a chemical biology approach in which we can measure the activity of DNA polymerase kappa.  We  have designed and synthesized N2-­benzyl-­2′-­deoxyguanosine and analogs that are highly select toward pol  kappa.  We have previously shown that in vitro, N2-­benzyl-­GTP reacts with pol κ 105-­fold more efficiently than  pol eta, iota, beta, nu, and delta, and in cells, the incorporation of N2-­4-­ethynylbenzyl-­dG into the DNA is  dependent on pol kappa.  With this tool we will examine the multiple roles of pol kappa in two following specific  aims:  (1) Determine the role of pol kappa in NER, and  (2) determine the role pol kappa plays during S-­phase.   In aim 1, we will examine the NER activity of pol kappa with respect to DNA damage, protein-­protein  interactions, and the location of the activity in the genome.  In aim 2 we will examine pol kappa activity in S-­ phase with respect to bypassing DNA damage and replication of non-­B DNA sequences.  In particular we will  examine the polymerase switch mechanisms at the replication fork, the role of protein-­protein interactions in  activation of pol kappa activity, and the location of pol kappa activity in the genome.  Similar techniques will be  employed in the two aims. (i)  Activity assays will be performed utilizing N2-­4-­ethynylbenzyl-­dG and Click  Chemistry to attach a fluorophore.  The activity will be analyzed by fluorescence microscopy to examine  nuclear/cytoplasmic localization of 4-­ethynylbenzyl-­dG, while flow cytometry will be used to examine cell-­cycle  activity. (ii)  These two techniques will be combined with mutant-­inactive-­proteins to determine the critical  proteins and interactions involved in the activity. (iii)  iPOND-­like experiments will be performed to identify  proteins associated with the activity in an unbiased manner. (iv)  DNA strand fiber assays will be employed to  distinguish between the polymerase switch mechanism and post-­gap repair during S-­phase.  (v) Next  generation sequencing will be utilized to probe the genomic identity of the activity.   This proposal is very  innovative in creating a new method by which scientists will be able to examine the activity of a single DNA  polymerase in a cell.   PUBLIC HEALTH RELEVANCE.  Differences in activity of DNA polymerase have a major impact on the ability  of an individual to respond to DNA damaging agents.  This methodology may be used in identifying the  susceptibility of individual or organs to carcinogens and the efficacy of DNA damaging chemotherapeutic  agents.

项目摘要 转录DNA合成（TLS）聚合酶通过取代高保真聚合酶而对细胞存活至关重要 在DNA修复和复制过程中发生的路障。在阐明的多重作用的一个困难， 这些聚合酶是不可能确定哪种聚合酶在特定情况下是活跃的。在这里， 提出了一种化学生物学的方法，我们可以测量DNA聚合酶κ的活性。我们 设计并合成了N2-N-苄基-N-2′-N-脱氧鸟苷及其类似物， 我们以前已经表明，在体外，N2-β-苄基-β-GTP与pol κ的反应效率比N2-β-苄基-β-GTP与pol κ的反应效率高105- 105倍。 pol η、iota、beta、nu和delta，并且在细胞中，N2-β 4-β乙炔基苄基-β-dG掺入DNA中是 依赖于pol kappa。使用此工具，我们将在以下两个特定的 目的：（1）确定pol kappa在NER中的作用;（2）确定pol kappa在S-Et期的作用。 在目的1中，我们将检测pol kappa的NER活性与DNA损伤、蛋白质-过氧化物酶蛋白的关系。 在目的2中，我们将检测S-κ B中的pol κ活性， 关于绕过DNA损伤和复制非-DNA序列的B阶段。特别地， 检查复制叉处的聚合酶开关机制，蛋白质-蛋白质相互作用在 pol κ活性的激活，以及pol κ活性在基因组中的定位。 （i）活性测定将利用N2-[4-（3-乙炔基苄基）-N，N-二甲基-N，N 化学方法附着荧光团。荧光显微镜将分析活性， 4-[乙炔基苄基]-β-dG的核/胞质定位，而流式细胞术将用于检测细胞周期 （ii）这两种技术将与突变体-β-失活-β-淀粉样蛋白结合，以确定关键的β-淀粉样蛋白。 （iii）将进行iPOND-1样实验以鉴定 （iv）DNA链纤维测定将用于 区分聚合酶开关机制和S-DNA期的DNA后缺口修复。（v）下一步 将利用世代测序来探测活性的基因组身份。 这个建议很 创新性地创造了一种新方法，科学家们将能够通过这种方法来检查单个DNA的活性， 细胞中的聚合酶。 公共卫生相关性：DNA聚合酶活性的差异对DNA聚合的能力有重大影响。 个体对DNA损伤剂的反应。这种方法可用于鉴定 个体或器官对致癌物的易感性和DNA损伤化疗的功效 剂.