Genotoxicity and Repair of Tobacco-Specific Nitrosamine DNA Adducts

烟草特异性亚硝胺 DNA 加合物的基因毒性和修复

• 批准号: 10406969
• 负责人: Thomas E Spratt
• 金额: $ 34.25万
• 依托单位: PENNSYLVANIA STATE UNIV HERSHEY MED CTR
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2012-07-20 至 2024-05-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10406969
• 关键词: Active Sites; Binding Sites; Biological Assay; Biology; Bypass; Carcinogens; Cell Cycle; Cell Survival; Cells; Cellular biology; Chemicals; Chemistry; DNA; DNA Adducts; DNA Crosslinking Agent; DNA Damage; DNA Repair; DNA Sequence; DNA biosynthesis; DNA replication fork; DNA-Directed DNA Polymerase; Databases; Deoxyguanosine; Eukaryotic Cell; Fiber; Flow Cytometry; Fluorescence Microscopy; Genome; Genomics; Goals; Guanosine Triphosphate; In Vitro; Individual; Kinetics; Knowledge; Location; Malignant Neoplasms; Measures; Methodology; Methods; Nitrosamines; Nuclear; Nucleotide Excision Repair; Nucleotides; Organ; Play; Polymerase; Positioning Attribute; Predisposition; Process; Proteins; Regulation; Research Personnel; Risk; Role; S phase; Scientist; Specificity; Techniques; Technology; Testing; Time; Tobacco; Tobacco-Related Carcinoma; adduct; analog; chemotherapeutic agent; crosslink; deoxyguanosine triphosphate; design; experimental study; fluorophore; genotoxicity; innovation; mutant; next generation sequencing; prevent; protein protein interaction; public health relevance; repaired; response; tool

Project Summary  Translesion DNA synthesis (TLS) polymerases are critical to cell survival by replacing high fidelity polymerases  during roadblocks that occur during DNA repair and replication. One difficulty in elucidating the multiple roles of  these polymerases is that it is impossible to identify which polymerase is active in a specific situation.  Here we  propose a chemical biology approach in which we can measure the activity of DNA polymerase kappa.  We  have designed and synthesized N2-­benzyl-­2′-­deoxyguanosine and analogs that are highly select toward pol  kappa.  We have previously shown that in vitro, N2-­benzyl-­GTP reacts with pol κ 105-­fold more efficiently than  pol eta, iota, beta, nu, and delta, and in cells, the incorporation of N2-­4-­ethynylbenzyl-­dG into the DNA is  dependent on pol kappa.  With this tool we will examine the multiple roles of pol kappa in two following specific  aims:  (1) Determine the role of pol kappa in NER, and  (2) determine the role pol kappa plays during S-­phase.   In aim 1, we will examine the NER activity of pol kappa with respect to DNA damage, protein-­protein  interactions, and the location of the activity in the genome.  In aim 2 we will examine pol kappa activity in S-­ phase with respect to bypassing DNA damage and replication of non-­B DNA sequences.  In particular we will  examine the polymerase switch mechanisms at the replication fork, the role of protein-­protein interactions in  activation of pol kappa activity, and the location of pol kappa activity in the genome.  Similar techniques will be  employed in the two aims. (i)  Activity assays will be performed utilizing N2-­4-­ethynylbenzyl-­dG and Click  Chemistry to attach a fluorophore.  The activity will be analyzed by fluorescence microscopy to examine  nuclear/cytoplasmic localization of 4-­ethynylbenzyl-­dG, while flow cytometry will be used to examine cell-­cycle  activity. (ii)  These two techniques will be combined with mutant-­inactive-­proteins to determine the critical  proteins and interactions involved in the activity. (iii)  iPOND-­like experiments will be performed to identify  proteins associated with the activity in an unbiased manner. (iv)  DNA strand fiber assays will be employed to  distinguish between the polymerase switch mechanism and post-­gap repair during S-­phase.  (v) Next  generation sequencing will be utilized to probe the genomic identity of the activity.   This proposal is very  innovative in creating a new method by which scientists will be able to examine the activity of a single DNA  polymerase in a cell.   PUBLIC HEALTH RELEVANCE.  Differences in activity of DNA polymerase have a major impact on the ability  of an individual to respond to DNA damaging agents.  This methodology may be used in identifying the  susceptibility of individual or organs to carcinogens and the efficacy of DNA damaging chemotherapeutic  agents.

项目总结： 跨损伤DNA合成酶(TLS)聚合酶是通过取代高保真的DNA合成酶聚合酶而对细胞存活至关重要的。 在DNA修复过程和复制过程中可能会遇到的障碍之一是，很难阐明DNA的多重作用。 这些聚合酶是这样的，即在一个特定的环境中，我们几乎不可能确定哪种聚合酶是最活跃的。 提出了一种新的化学和生物学方法，在这种方法中，我们可以直接测量DNA聚合酶Kappa的活性。 已经设计和合成了N_2-苄基-2‘-脱氧鸟苷和其他类似物，它们是高度精选的。 Kappa：我们之前已经证明，在体外，N-N-苄基-GTP与κ的反应效率是前者的105倍，后者是后者的105倍。 POL，ETA，ETA，BETA，TNU，BETA，DNU，ETA和TELTA在细胞中的表达，以及将N_2-β-4-乙炔基苯并-DG掺入细胞DNA的过程中。 依赖于刑警组织的卡帕。有了这个工具，我们将在接下来的两年里审查刑警组织卡帕的多重角色。 目的：(1)确定刑警组织在三个阶段中的主要作用；(2)确定刑警组织在S阶段发挥的主要作用。 在目标1中，我们将在不尊重DNA和蛋白质损伤的情况下，审查刑警组织最重要的活动指标。 相互作用、相互作用和相互作用是人类基因组中最大的活性中心。我们将不会在S的第二个目标中检查刑警组织的卡巴中心的活动。 阶段结束时，我们尊重的是如何绕过DNA损伤，以及如何复制非乙肝病毒的DNA序列。尤其是我们将。 在复制分叉上研究蛋白质聚合酶基因开关的机制，研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要作用。 刑警组织核糖核酸酶活性的激活，以及在人类基因组中发现的刑警组织核糖核酸酶活性的第一位点。将不会有类似的基因技术。 受雇于这两个目标。(I)分析的活动将不会通过使用N_2-n-4-乙炔基苄基-D_G和C_Click来执行。 化学需要附加一个新的荧光团。所有的活性都将通过荧光显微镜进行分析，以进行进一步的检查。 4-乙炔基苄基-DG的核/细胞质定位技术，而流式细胞术技术将不再用于进一步检查细胞周期。 活性。(Ii)将这两项新技术与突变的非活性蛋白质结合起来，以确定关键的蛋白质。 蛋白质和蛋白质的相互作用参与了这一活动。我们将继续进行类似iPOND的实验，以进一步鉴定。 与酶活性相关的蛋白质以一种非常公正的方式进行检测。(Iv)对DNA链和纤维的分析将不会被广泛使用。 在S阶段，区分基因聚合酶基因开关的机制和缝隙修复后的基因。 我们还将利用基因测序技术来探索这一活动的基因组学特征。他说，这项新的提议是非常有意义的。 在创造一种新的DNA检测方法方面的创新成果，科学家们表示，这种方法将能够更好地研究人类单一DNA的活性。 聚合酶作用于一种新的细胞。 与公共卫生相关。DNA聚合酶活性的差异对人类的生存能力产生了重大影响。 这是一种对DNA具有破坏性的毒物做出反应的个人方法。这种方法也可能被用来识别病毒。 个体器官对致癌物质的易感性增加，破坏化疗药物的DNA的药效降低。 探员们。