A Scalable Neuron-Based High-Throughput Screening Platform for the Discovery of Compounds that Restore Protein Expression Caused by Genetic Haploinsufficiency

项目总结： -- 治疗神经精神障碍的药物发现和管道是非常枯竭的。一种可能的方法是让这些管道恢复活力。 我们将无法根据初级神经细胞中的相关疾病和表型来创建新的分析方法，这是不可能的。 目前还缺乏。然而，一个高度可扩展的测试和开发平台，它是基于真正的神经元，。 在过去的五年里，HTS仍然是经济高效的，它可以很好地支持HTS目前不存在的工业成本水平。 多年来，我们的合作小组已经创建了一个非常灵活的系统和一个可扩展的初级神经元细胞分析和开发系统。 这与工业级的HTS非常兼容。在这里，我们的主要目标是进一步优化这些新程序和新的工作流程。 为了更好地确定基于神经元的HTS的可扩展性极限，需要进行表型分析，以便它们可以很容易地检测出来。 支持非常大规模的广告宣传活动，包括200,000个化合物。 相当大比例的儿童脑功能障碍是由一种单一的常染色体显性遗传变异引起的。 从而导致遗传和单倍体不足。这是一种罕见的遗传性和脑部疾病，这种疾病是由这些基因变异提供的。 发现一种强大的治疗方法的潜力最大，因为这种疾病的治疗机制通常是直截了当的。 (即低蛋白质和低表达)。因此，我们提出了一个新的战略基础，以进一步改善这些患者的病情，因为这是不可能的。 用一种神奇的化合物来治疗它们，这种化合物可以从剩余的蛋白质中提高功能蛋白质的表达水平。 未损坏的等位基因基因(如“促进基因化合物”)。可能导致SYNGAP1的变异体的无稽之谈。 单倍体功能不全可能导致患有自闭症和癫痫的遗传性智力障碍患者(MRD5；;)。 OMIM#603384)表示，他们可能无法解释高达1%-2%的ID障碍病例。但他们认为这一障碍的原因很低。 神经元中功能性基因蛋白的表达下降，最常见的原因是截断SYNGAP1基因的无稽之谈和变体。 这意味着我们将进一步完善基于神经元的HTS智能系统，并进一步推进ASD相关智能障碍的治疗方案。 他们正在寻求扩大规模的方法，并将实施一种新的SynGAP表达模式的测试方法，该方法与标准兼容。 工业级机器人技术。为了实现第一个目标，我们将进一步优化与HTS兼容的应用程序和与疾病相关的应用程序SynGAP。 表达和检测。这项检测是基于小鼠的初级神经细胞，而番茄的荧光检测反映了这一点。 稳定的内源性SynGAP和蛋白质水平。为了实现第二个目标，我们将继续将SynGAP微型化。 Expression测试需要支持最新的1536-Well格式。这一微型化的过程将使我们能够实现HTS-？规模的屏幕测试。 这项或任何其他相关的基于神经元的表型分析，包括多达40万个水井培养，并使用一个新的标准。 筛选和预算。最后，我们将继续实施新的SynGAP和表达分析测试，以建立一个真正的超高温超导环境。 然后验证和引导从飞行员屏幕上出现的20K化合物，包括10K化合物。 将已知的“对人体安全”化合物的屏幕重新调整用途。这一新项目的实际影响可能会超出我们的预期。 制定新的程序，使HTS运动在神经元中的总规模增加约10倍或更多，以实现这一目标。 目前在学术研究和筛查中心是最先进的。我们还预计政府将至少验证一种化合物。 这将促进SynGAP的表达，希望能从重新调整其用途的库中恢复过来。

PROJECT SUMMARY    Drug discovery pipelines for neuropsychiatric disorders are dry. One approach to rejuvenating these pipelines  would  be  to  create  assays  based  on  relevant  disease  phenotypes  in  primary  neurons,  something  that  is  currently  lacking.  However,  a  scalable  assay  development  platform  that  is  based  on  bona  fide  neurons,  remains  cost  effective,  and  that  can  support  industrial  level  HTS  does  not  currently  exist.  Over  the  past  five  years, our collaborative group has created a flexible and scalable primary neuron assay development system  that is compatible with industrial-­level HTS. Here, our goal is to optimize these procedures and workflows  to  determine  the  limit  of  scalability  of  neuron-­based  HTS  phenotypic  assays  so  that  they  can  easily  support very large campaigns of >200K compounds.    A  substantial  proportion  of  childhood  brain  disorders  are  caused  by  single  autosomal  dominant  variants  resulting in genetic haploinsufficiency. The rare genetic brain disorders that arise from these variants offer the  greatest potential for discovery of robust therapeutics because the disease mechanism is often straight forward  (i.e. low protein expression). Therefore, a rationale strategy to improve conditions in these patients would be to  treat  them  with  “magic  bullet”  compounds  that  raise  expression  of  functional  proteins  from  the  remaining  undamaged  allele  (e.g.  “boosting  compounds”).  De  novo  nonsense  variants  that  cause  SYNGAP1  haploinsufficiency  lead  to  a  genetically-­defined  form  of  intellectual  disability  with  autism  and  epilepsy  (MRD5;;  OMIM#603384)  that  may  explain  up  to  1-­2%  of  all  ID  cases.  The  accepted  cause  of  this  disorder  is  low  functional protein expression in neurons caused most often by truncating SYNGAP1 nonsense variants. As a  means to refine the neuron-­based HTS system, and to advance treatment for ASD-­related disorders, we  are  seeking  to  scale-­up  and  implement  an  assay  for  SynGAP  expression  that  is  compatible  with  industrial-­level robotics. In the first Aim, we will optimize an HTS-­compatible and disease-­relevant SynGAP  expression  assay.  This  assay  is  based  on  mouse  primary  neurons  where  tdTomato  fluorescence  reflects  steady-­state  endogenous  SynGAP  protein  levels.  In  the  second  aim,  we  will  miniaturize  the  SynGAP  expression assay to the 1536-­well format. This miniaturization process would enable an HTS-­scale screen of  this,  or  any  other  related  neuron-­based  phenotypic  assay,  of  up  to  400,000  culture  wells  using  a  standard  screening budget. Finally, we will implement the SynGAP expression assay in a true uHTS environment and  then  validate  lead  compounds  that  emerge  from  a  20K  compound  pilot  screen,  including  a  10K  compound  repurposing  screen  of  known  “safe  in  human”  compounds.  The  impact  of  this  project  that  we  expect  to  develop procedures that will increase the scale of HTS campaigns in neurons by 10-­fold or more relative to the  current state-­of-­the-­art in academic screening centers. We also expect to validate at least one lead compound  that boosts SynGAP expression, hopefully from the repurposing library.