A Scalable Neuron-Based High-Throughput Screening Platform for the Discovery of Compounds that Restore Protein Expression Caused by Genetic Haploinsufficiency

项目摘要 神经精神疾病的药物发现管道是干燥的。振兴这些管道的一种方法是 将是建立基于原代神经元中相关疾病表型的检测方法， 目前缺乏。 然而，基于真正神经元的可扩展的测定开发平台， 仍然具有成本效益，并且可以支持工业级HTS目前还不存在。 过去五 多年来，我们的合作小组已经创建了一个灵活和可扩展的原代神经元测定开发系统， 与工业级高温超导体兼容。我们的目标是优化这些程序和工作流程 以确定基于神经元的HTS表型测定的可扩展性的极限， 支持> 200 K化合物的大规模生产。 很大一部分儿童期脑疾病是由单一的常染色体显性变异引起的 导致遗传单倍不足。由这些变异引起的罕见遗传性大脑疾病提供了 最大的潜力，发现强大的治疗方法，因为疾病的机制往往是直接的 (i.e.低蛋白表达）。因此，改善这些患者状况的基本策略是 用“神奇子弹”化合物治疗它们， 未受损的等位基因（例如“加强化合物”）。 引起SYNGAP 1的新生无义变体 单倍性不足导致一种遗传学上定义的智力残疾形式，包括自闭症和癫痫（MRD 5; OMIM#603384），可以解释高达1- 102%的所有ID病例。 这种疾病的公认原因是低 神经元中的功能性蛋白质表达最常由截短SYNGAP 1无义变体引起。作为 为了完善基于神经元的HTS系统，并推进ASD相关疾病的治疗，我们 正在寻求扩大规模，并实施一种与SynGAP表达相容的测定法， 工业级机器人。在第一个目标中，我们将优化一个HTS-100兼容和疾病相关的SynGAP 表达测定 该测定基于小鼠原代神经元，其中tdTomato荧光反映了 稳态内源性SynGAP蛋白水平。 在第二个目标中，我们将对SynGAP进行验证 表达测定至1536-微孔板格式。这种小型化过程将使一个高温超导体的规模屏幕， 这种或任何其他相关的基于神经元的表型分析，使用标准的 筛选预算最后，我们将在真正的uHTS环境中实施SynGAP表达测定， 然后验证从20 K化合物中试筛选中出现的先导化合物，包括10 K化合物 重新利用已知的“对人体安全”的化合物。 我们预计这个项目的影响 开发程序，使神经元中HTS运动的规模增加10倍或更多， 学术筛选中心的最新技术水平。我们还希望验证至少一种先导化合物 它能促进SynGAP的表达，希望是来自于再利用库。

PROJECT SUMMARY    Drug discovery pipelines for neuropsychiatric disorders are dry. One approach to rejuvenating these pipelines  would  be  to  create  assays  based  on  relevant  disease  phenotypes  in  primary  neurons,  something  that  is  currently  lacking.  However,  a  scalable  assay  development  platform  that  is  based  on  bona  fide  neurons,  remains  cost  effective,  and  that  can  support  industrial  level  HTS  does  not  currently  exist.  Over  the  past  five  years, our collaborative group has created a flexible and scalable primary neuron assay development system  that is compatible with industrial-­level HTS. Here, our goal is to optimize these procedures and workflows  to  determine  the  limit  of  scalability  of  neuron-­based  HTS  phenotypic  assays  so  that  they  can  easily  support very large campaigns of >200K compounds.    A  substantial  proportion  of  childhood  brain  disorders  are  caused  by  single  autosomal  dominant  variants  resulting in genetic haploinsufficiency. The rare genetic brain disorders that arise from these variants offer the  greatest potential for discovery of robust therapeutics because the disease mechanism is often straight forward  (i.e. low protein expression). Therefore, a rationale strategy to improve conditions in these patients would be to  treat  them  with  “magic  bullet”  compounds  that  raise  expression  of  functional  proteins  from  the  remaining  undamaged  allele  (e.g.  “boosting  compounds”).  De  novo  nonsense  variants  that  cause  SYNGAP1  haploinsufficiency  lead  to  a  genetically-­defined  form  of  intellectual  disability  with  autism  and  epilepsy  (MRD5;;  OMIM#603384)  that  may  explain  up  to  1-­2%  of  all  ID  cases.  The  accepted  cause  of  this  disorder  is  low  functional protein expression in neurons caused most often by truncating SYNGAP1 nonsense variants. As a  means to refine the neuron-­based HTS system, and to advance treatment for ASD-­related disorders, we  are  seeking  to  scale-­up  and  implement  an  assay  for  SynGAP  expression  that  is  compatible  with  industrial-­level robotics. In the first Aim, we will optimize an HTS-­compatible and disease-­relevant SynGAP  expression  assay.  This  assay  is  based  on  mouse  primary  neurons  where  tdTomato  fluorescence  reflects  steady-­state  endogenous  SynGAP  protein  levels.  In  the  second  aim,  we  will  miniaturize  the  SynGAP  expression assay to the 1536-­well format. This miniaturization process would enable an HTS-­scale screen of  this,  or  any  other  related  neuron-­based  phenotypic  assay,  of  up  to  400,000  culture  wells  using  a  standard  screening budget. Finally, we will implement the SynGAP expression assay in a true uHTS environment and  then  validate  lead  compounds  that  emerge  from  a  20K  compound  pilot  screen,  including  a  10K  compound  repurposing  screen  of  known  “safe  in  human”  compounds.  The  impact  of  this  project  that  we  expect  to  develop procedures that will increase the scale of HTS campaigns in neurons by 10-­fold or more relative to the  current state-­of-­the-­art in academic screening centers. We also expect to validate at least one lead compound  that boosts SynGAP expression, hopefully from the repurposing library.