A Scalable Neuron-Based High-Throughput Screening Platform for the Discovery of Compounds that Restore Protein Expression Caused by Genetic Haploinsufficiency

项目总结

PROJECT SUMMARY    Drug discovery pipelines for neuropsychiatric disorders are dry. One approach to rejuvenating these pipelines  would  be  to  create  assays  based  on  relevant  disease  phenotypes  in  primary  neurons,  something  that  is  currently  lacking.  However,  a  scalable  assay  development  platform  that  is  based  on  bona  fide  neurons,  remains  cost  effective,  and  that  can  support  industrial  level  HTS  does  not  currently  exist.  Over  the  past  five  years, our collaborative group has created a flexible and scalable primary neuron assay development system  that is compatible with industrial-­level HTS. Here, our goal is to optimize these procedures and workflows  to  determine  the  limit  of  scalability  of  neuron-­based  HTS  phenotypic  assays  so  that  they  can  easily  support very large campaigns of >200K compounds.    A  substantial  proportion  of  childhood  brain  disorders  are  caused  by  single  autosomal  dominant  variants  resulting in genetic haploinsufficiency. The rare genetic brain disorders that arise from these variants offer the  greatest potential for discovery of robust therapeutics because the disease mechanism is often straight forward  (i.e. low protein expression). Therefore, a rationale strategy to improve conditions in these patients would be to  treat  them  with  “magic  bullet”  compounds  that  raise  expression  of  functional  proteins  from  the  remaining  undamaged  allele  (e.g.  “boosting  compounds”).  De  novo  nonsense  variants  that  cause  SYNGAP1  haploinsufficiency  lead  to  a  genetically-­defined  form  of  intellectual  disability  with  autism  and  epilepsy  (MRD5;;  OMIM#603384)  that  may  explain  up  to  1-­2%  of  all  ID  cases.  The  accepted  cause  of  this  disorder  is  low  functional protein expression in neurons caused most often by truncating SYNGAP1 nonsense variants. As a  means to refine the neuron-­based HTS system, and to advance treatment for ASD-­related disorders, we  are  seeking  to  scale-­up  and  implement  an  assay  for  SynGAP  expression  that  is  compatible  with  industrial-­level robotics. In the first Aim, we will optimize an HTS-­compatible and disease-­relevant SynGAP  expression  assay.  This  assay  is  based  on  mouse  primary  neurons  where  tdTomato  fluorescence  reflects  steady-­state  endogenous  SynGAP  protein  levels.  In  the  second  aim,  we  will  miniaturize  the  SynGAP  expression assay to the 1536-­well format. This miniaturization process would enable an HTS-­scale screen of  this,  or  any  other  related  neuron-­based  phenotypic  assay,  of  up  to  400,000  culture  wells  using  a  standard  screening budget. Finally, we will implement the SynGAP expression assay in a true uHTS environment and  then  validate  lead  compounds  that  emerge  from  a  20K  compound  pilot  screen,  including  a  10K  compound  repurposing  screen  of  known  “safe  in  human”  compounds.  The  impact  of  this  project  that  we  expect  to  develop procedures that will increase the scale of HTS campaigns in neurons by 10-­fold or more relative to the  current state-­of-­the-­art in academic screening centers. We also expect to validate at least one lead compound  that boosts SynGAP expression, hopefully from the repurposing library.