从成纤维细胞凋亡的内质网应激途径探讨丝裂霉素预防椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连的机制

研究目的：探讨MMC对人成纤维细胞的影响。内质网应激在MMC诱导人成纤维细胞凋亡中的作用及机制研究。活性氧（ROS）在内质网应激参与MMC诱导人成纤维细胞凋亡中的作用及机制研究。.实验方法：CCK-8检测不同干预对成纤维细胞活性的影响。流式细胞分析技术检测细胞凋亡率和细胞周期。TUNEL法检测细胞凋亡。Western blot法检测Cleaved Caspase-3、PRAP、Cleaved PRAP的水平变化及活化情况。实时定量PCR检测XBP-1、CHOP和GRP78 mRNA的转录情况。Western blot法检测P-PERK、PERK、P-eIF2α、eIF2α、ATF6、P-IRE1、IRE1、GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2、Bim和Cleaved Caspase-3的表达及活化情况。siRNAs或慢病毒转染等基因沉默证明内质网应激相关蛋白与MMC诱导人成纤维细胞凋亡的相关性。DCFH-DA检测ROS在人成纤维细胞中的水平变化。Western blot法检测加入与不加入抗氧化剂内质网应激和细胞凋亡相关蛋白的表达及活化情况。.实验结果：MMC明显降低人成纤维细胞细胞的活性，并且呈MMC浓度和用药时间依赖性。流式细胞结果示MMC显著提高人成纤维细胞的凋亡率，并使细胞周期阻滞在G1期。TUNEL检测结果示MMC显著提高人成纤维细胞的晚期凋亡。MMC显著增加人成纤维细胞内质网应激相关蛋白活化及表达量，且呈浓度和时间依赖性。转染CHOP siRNA减少CHOP蛋白表达，显著降低MMC诱导的人成纤维细胞凋亡。凋亡相关蛋白Bim的表达水平也显著降低。转染PERK shRNA减少PERK蛋白表达，显著降低MMC诱导的人成纤维细胞凋亡。同时显著下调MMC诱导增加的凋亡相关蛋白CHOP、Bim和Cleaved Caspase-3的表达水平。MMC明显增加人成纤维细胞内的ROS生成。抗氧化剂预处理人成纤维细胞，显著抑制MMC诱导增加的人成纤维细胞内质网应激和细胞凋亡相关蛋白表达水平或活化。.结论：MMC显著增加人成纤维细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的剪切活化，从而导致凋亡。内质网应激途径的PERK通路在MMC诱导的人成纤维细胞凋亡中起关键性作用。MMC通过诱导ROS的生成，进而激活内质网应激中凋亡相关蛋白，最终引起人成纤维细胞的凋亡。