从成纤维细胞凋亡的内质网应激途径探讨丝裂霉素预防椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连的机制

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81171694
项目类别：
面上项目
资助金额：
60.0万
负责人：
曹晓建
依托单位：
南京医科大学
学科分类：
H0604.骨、关节、软组织损伤与修复
结题年份：
2015
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
刘军；张爱梁；阙军；眭涛；孔德超；姚莉；
关键词：
瘢痕内质网应激

项目摘要

椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连的预防，一直是困扰临床的难题。近年发现丝裂霉素（MMC）预防硬膜外瘢痕粘连有显著疗效，并初步证实其作用机制为MMC通过经典途径（线粒体和死亡受体途径）诱导成纤维细胞凋亡来实现。但国外学者和我们前期研究显示阻断经典途径，只能部分抑制成纤维细胞凋亡，提示其他途径可能参与其凋亡过程。我们假设内质网应激途径参与MMC诱导成纤维细胞凋亡过程。本课题拟用大鼠椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连模型，观察内质网应激在MMC诱导成纤维细胞凋亡中的作用，通过检测内质网应激关键分子CHOP，Caspase-12和JNK在凋亡过程中表达水平的变化，用RNA干扰技术抑制CHOP和caspase-12的表达，探讨其对硬膜外瘢痕成纤维细胞凋亡的影响，从正反两方面阐明MMC诱导成纤维细胞经内质网途径凋亡的确切信号通路，揭示MMC预防硬膜外瘢痕粘连的确切机制，为硬膜外瘢痕粘连的预防提供新的方法和研究思路。

结项摘要

研究目的：探讨MMC对人成纤维细胞的影响。内质网应激在MMC诱导人成纤维细胞凋亡中的作用及机制研究。活性氧（ROS）在内质网应激参与MMC诱导人成纤维细胞凋亡中的作用及机制研究。.实验方法：CCK-8检测不同干预对成纤维细胞活性的影响。流式细胞分析技术检测细胞凋亡率和细胞周期。TUNEL法检测细胞凋亡。Western blot法检测Cleaved Caspase-3、PRAP、Cleaved PRAP的水平变化及活化情况。实时定量PCR检测XBP-1、CHOP和GRP78 mRNA的转录情况。Western blot法检测P-PERK、PERK、P-eIF2α、eIF2α、ATF6、P-IRE1、IRE1、GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2、Bim和Cleaved Caspase-3的表达及活化情况。siRNAs或慢病毒转染等基因沉默证明内质网应激相关蛋白与MMC诱导人成纤维细胞凋亡的相关性。DCFH-DA检测ROS在人成纤维细胞中的水平变化。Western blot法检测加入与不加入抗氧化剂内质网应激和细胞凋亡相关蛋白的表达及活化情况。.实验结果：MMC明显降低人成纤维细胞细胞的活性，并且呈MMC浓度和用药时间依赖性。流式细胞结果示MMC显著提高人成纤维细胞的凋亡率，并使细胞周期阻滞在G1期。TUNEL检测结果示MMC显著提高人成纤维细胞的晚期凋亡。MMC显著增加人成纤维细胞内质网应激相关蛋白活化及表达量，且呈浓度和时间依赖性。转染CHOP siRNA减少CHOP蛋白表达，显著降低MMC诱导的人成纤维细胞凋亡。凋亡相关蛋白Bim的表达水平也显著降低。转染PERK shRNA减少PERK蛋白表达，显著降低MMC诱导的人成纤维细胞凋亡。同时显著下调MMC诱导增加的凋亡相关蛋白CHOP、Bim和Cleaved Caspase-3的表达水平。MMC明显增加人成纤维细胞内的ROS生成。抗氧化剂预处理人成纤维细胞，显著抑制MMC诱导增加的人成纤维细胞内质网应激和细胞凋亡相关蛋白表达水平或活化。.结论：MMC显著增加人成纤维细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的剪切活化，从而导致凋亡。内质网应激途径的PERK通路在MMC诱导的人成纤维细胞凋亡中起关键性作用。MMC通过诱导ROS的生成，进而激活内质网应激中凋亡相关蛋白，最终引起人成纤维细胞的凋亡。