中电导钙激活钾通道kca3.1在肾固有细胞间充质转分化过程中的作用研究

肾脏纤维化是导致慢性肾功能衰竭的主要原因，是肾脏病学界研究的热点和重点领域。既往研究发现钙激活钾离子通道Kca3.1参与肾间质纤维化的发生发展，但与肾小球硬化、对肾脏固有细胞上皮间充质转分化的研究未有报道。本研究自获资助后，根据原实验方案：1.进行体外实验：⑴.培养大鼠肾脏系膜细胞( HZYB- 1) 细胞株和肾小管上皮细胞（NRK-52E）细胞株，采用不同浓度TGF- ß1和血管紧张素Ⅱ诱导细胞增殖，确定TGF- ß1和血管紧张素Ⅱ诱导浓度分别为2ng/ml、100nM，作用时间为48h。⑵.采用流失细胞技术、MTT方法、western-blot和RT-PCR等分子生物学技术，观察不同浓度TRAM-34对细胞增殖的作用，结果发现：16nM的TRAM可以将系膜细胞阻滞于G0-G1期，细胞增殖减弱，与增殖和上皮细胞间充质转分化相关的α-SMA、FSP-1和Kca3.1蛋白和mRNA均有显著下降（P＜0.05），细胞分泌胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Fibronectin均有改变（数据统计中）；⑶.采用激光共聚焦和免疫荧光技术，确定Kca3.1在系膜细胞和肾小管上皮细胞中的定位，结果发现：Kca3.1位于细胞浆中，TGF-β(2ng/mL)可快速刺激系膜细胞内Ca2+升高。TGF-β刺激的细胞内Ca2+升高表现为峰型升高，给予TRAM34 16nM后细胞内Ca2+升高快速被抑制。⑷.采用电生理膜片钳技术观察系膜细胞和小管上皮细胞上Kca3.1的电生理学变化，结果证实：在系膜细胞上记录到中电导钙激活钾通道(KCa3.1)，该通道电导55ps；小管细胞的电生理学特性正在进行中。2.体外实验：建立SD大鼠IgA肾病模型和UUO大鼠模型，大鼠24小时尿蛋白和血尿明显，其中采用免疫荧光技术检测，肾小球系膜区有IgA沉积，证明IgA肾病模型造模成功。后续实验结果正在统计中。3.通过体内、体外实验结果，kac3.1参与了肾小球硬化的发生、发展，可能与其参与了系膜细胞和小管上皮细胞间充质转分化有关。4.采用祛风通络方剂和新型抗纤维化药物（sorafenib）分别作用于体外培养的系膜细胞和肾小管上皮细胞，以及UUO模型大鼠，发现均对细胞增殖和纤维化具有抑制作用，但是否通过Kca3.1通道，实验正在进行中。5.在本实验基础上，课题组成员申请国家自然科学基金青年项目1项，其他基金2项，培养学生2名。