微小変化型ネフローゼ症候群におけるDNAメチル化を指標とした病態診断法の開発

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微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）は小児ネフローゼ患者の約７５％を占める主要な疾患であるが、大量の蛋白尿を呈するほかには病態・症状の変化をとらえることのできるマーカーは知られていない。本研究では研究者のグループが同定したＭＣＮＳ患者の病態の変化と相関してＤＮＡメチル化が変化する遺伝子８２種のDNAメチル化を指標としてMCNS患者の病態診断法を確立することを目標とする。検体の採取：本研究では蛋白尿を呈する再発期、治療により蛋白尿が消失した寛解期、および年齢・性別を一致させた健常ボランティア末梢血から単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離後、ナイーブＴ細胞を抗体磁気ビーズ法で分取しそのＤＮＡのメチル化の変化をメチル化感受性制限酵素処理・定量ＰＣＲ法によって解析する。再発時のサンプルを9患者分、寛解期２患者分のＰＢＭＣを採取・保存した。メチル化感受性制限酵素HpaII法によるDNAメチル化率の検出:８２遺伝子のうちＩＰＡ解析の結果、オントロジー解析、パスウェイ解析などの結果を総合して１２の遺伝子をターゲット遺伝子として選定した。ＭＩＡＭＩ法で用いたプローブを挟む上流・下流2か所のHapaII制限酵素サイト（CCGG)を挟む形で、メチル化検出プライマーを設計した。またHapaII制限酵素サイトの手前に、コントロールプライマーを設定した。CpGノンメチルＪｕｒｋａｔ　ＤＮＡをよび完全メチル化ＤＮＡを混合し、０－100%メチル化ＤＮＡを調整した。HpaII およびＭｓｐＩで完全消化し、設計したメチル化検出プライマーおよびコントロールプライマーを用いて定量ＰＣＲを行った。結果、プライマーにより、ＤＮＡのメチル化をよく反映するものもあるが、ほぼ増幅に変化がみられないものもあった。　今後診断に用いるためには、より慎重にプライマーの設計を行ってゆく必要があることが分かった。