Molecular basis of action and pathogenesis of Clostridium difficile toxin B

项目总结： 难辨梭状芽胞杆菌B毒素(TcdB)是一种重要的致病致病因子。 对于艰难梭菌的感染，我们对Tcdb的致病机制的了解仍然有限，这是因为我们对Tcdb的致病机制的了解很有限。 这在很大程度上是因为缺乏已建立的受体，通过这些受体可以更好地了解体内靶向的作用。 而疾病的进展是在结肠组织中进行的。我们最近还使用进行了全基因组筛查。 最新的CRISPR-èCas9方法发现了两个截然不同的候选受体：Frizzleed家族。 蛋白质组分(FZDS)和硫酸软骨素/蛋白多糖组分(CSPG4)。我们进一步证明了这一点。 FZD和CSPG4都是TcdB的功能性受体，它们各自都可以调节结合的信号和信号。 TcdB的进入是独立的。然而，FZD和CSPG4是如何参与TcdB的发病机制的。 在艰难梭菌感染期间的结肠和结肠组织中，仍有待进一步确定。在这里，我们提出三种方法。 旨在进一步解决这一关键的知识和技术障碍。 -- 首先，我们发现FZD基因和CSPG4基因在结肠组织中没有差异表达，FZD基因也是如此。 主要是在结肠上皮细胞和CSPG4主要在上皮下层和肌成纤维细胞中表达。 因此，我们可以提出一个新颖的“双受体、两阶段”假说来更好地解释TcdB的发病机制： TcdB首先靶向FZD，并通过与FZD结合的分子进入结肠上皮，从而破坏FZD。 上皮细胞使细菌毒素能够更多地接触到肌成纤维细胞的亚上皮细胞，这是TcdB利用的地方。 CSPG4被认为是一种新的替代受体。它的目标是1%和2%，它们将检验这一假设，目标是1%。 重点关注FZD的主要作用，以确保TcdB结合蛋白和进入结肠上皮细胞的能力。 艰难梭菌在各种动物模型中的感染，他们和他们的目标是2，重点关注CSPG4基因和肌成纤维细胞的主要作用。 在艰难梭菌感染过程中，Tcdb的致病机制也不同。此外，我们还发现，细菌对Tcdb的结合作用。 TcdB抑制FZD，从而抑制Wnt信号，这对结肠干细胞来说是必不可少的。 假设一种新的促进TcdB发病的新机制：Tcdb可能会扰乱结肠功能。 干细胞是通过毒素-受体相互作用实现的，其主要酶活性独立于细胞内。 AIM-3将通过进一步检查生物和病理的后果来检验这一假说。 Wnt信号传递抑制信号与利用结肠有机化合物感染模型的相关性。 在动物模型上进行的实验是用基因工程的艰难梭菌进行的，这种细菌能够表达与受体结合的细菌。 TcdB.的领域。我们还将继续探索葛兰素史克-3受体抑制剂的潜在治疗和益处机制，这将是一项重要的研究。 调制WNT信号，以减少在体外循环过程中Tcdb对结肠上皮的损伤。 艰难梭菌感染。将这些研究结合在一起，将为我们提供一个更好的分子水平来了解这种疾病。 艰难梭菌感染期间进展缓慢，有可能导致新的治疗性药物干预措施。

Project Summary  Clostridium difficile toxin B (TcdB) is a major virulent factor responsible for diseases associated  with  C.  difficile  infection.  Our  understanding  of  TcdB  pathogenesis  remains  limited,  owing  in  large  part  to  a  lack  of  established  receptors  through  which  to  understand  the  in  vivo  targeting  and disease progression in colonic tissues. We recently carried out genome-­wide screens using  the  CRISPR-­Cas9  approach  and  identified  two  distinct  candidate  receptors:  Frizzled  family  proteins (FZDs) and chondroitin sulfate proteoglycan 4 (CSPG4). We further demonstrated that  both  FZDs  and  CSPG4  are  functional  receptors  for  TcdB,  and  each  can  mediate  binding  and  entry of TcdB independently. However, how FZDs and CSPG4 contribute to TcdB pathogenesis  in colonic tissues during C. difficile infection remains to be established. Here we propose three  aims to address this key knowledge barrier.     First, we found that FZDs and CSPG4 are differentially expressed in colonic tissues, with FZDs  mainly in the colonic epithelium and CSPG4 largely expressed in sub-­epithelial myofibroblasts.  We  thus  propose  a  novel  “two-­receptor,  two-­stage”  hypothesis  to  explain  TcdB  pathogenesis:  TcdB  first  targets  and  enter  the  colonic  epithelium  via  binding  to  FZDs.  Disruption  of  the  epithelium  allows  the  toxin  to  gain  access  to  sub-­epithelial  myofibroblasts,  where  TcdB  utilizes  CSPG4  as  an  alternative  receptor.  Aims  1  and  2  will  examine  this  hypothesis,  with  Aim  1  focusing  on  the  role  of  FZDs  for  TcdB  binding  and  entry  into  the  colonic  epithelium  during  C.  difficile infection in animal models, and Aim 2 focusing on the role of CSPG4 and myofibroblasts  in  TcdB  pathogenesis  during  C.  difficile  infection.  Furthermore,  we  also  found  that  binding  of  TcdB  to  FZDs  inhibits  Wnt  signaling,  which  is  essential  for  colonic  stem  cells.  We  thus  hypothesize  a  novel  mechanism  contributing  to  TcdB  pathogenesis:  TcdB  may  disrupt  colonic  stem cells through toxin-­receptor engagement, independent of its enzymatic activity inside cells.  Aim  3  will  test  this  hypothesis  by  examining  the  biological  consequences  and  pathological  relevance  of  Wnt  signaling  inhibition  utilizing  colonic  organoid  models  and  by  infection  experiments  in  animal  models  with  engineered  C.  difficile  that  expressing  the  receptor-­binding  domain  of  TcdB.  We  will  also  explore  the  therapeutic  benefit  of  GSK-­3  inhibitors,  which  modulate  Wnt  signaling,  for  reducing  the  damage  to  the  colonic  epithelium  by  TcdB  during  C.  difficile  infection.  Together,  these  studies  will  provide  a  molecular  understanding  of  disease  progression during C. difficile infection and potentially lead to novel therapeutic interventions.