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Nature子刊 | 浙江大学吕志民团队发现：PFKL介导脂滴—线粒体互作，是促进肿瘤细胞存活和增殖的新机制
Highlights
1. 糖酵解酶PFKL在肿瘤细胞中具有调控脂解过程的非传统功能。
2. PFKL通过其蛋白激酶活性，促进PLIN2与CPT1A的结合，导致脂滴与线粒体的接近和联系。
3. PFKL介导的PLIN2磷酸化与HCC的临床侵袭性之间的正相关性
“Nature Metabolism”（IF=18.9）上有一篇题为“Glycolytic enzyme PFKL governs lipolysis by promoting lipid droplet–mitochondria tethering to enhance β-oxidation and tumor cell proliferation”的文章。这篇文章揭示了PFKL在肿瘤细胞中的非传统功能。
研究背景介绍
磷酸果糖激酶肝型（PFKL）是糖酵解途径中的一个关键酶，负责催化将果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸，是糖酵解过程中的一个限速步骤。
脂滴是细胞内储存中性脂质（如三酰甘油和胆固醇酯）的重要结构，被一层极性磷脂和相关蛋白（如PLIN蛋白）所包围。脂滴在能量代谢、细胞信号传导和应对营养应激中起着关键作用。
PLIN2是一种与脂滴相关的蛋白，参与调节脂滴的合成和分解。
β-氧化是脂肪酸在细胞内线粒体中分解产生能量的过程。在能量应激条件下，如葡萄糖缺乏时，β-氧化成为肿瘤细胞维持生存和增殖的重要能量来源。
研究思路分析
研究技术路线图01PFKL的功能与脂滴-线粒体相互作用
①通过LC-MS/MS对从葡萄糖缺乏的Huh7人类HCC细胞中纯化了脂滴进分析，发现线粒体外膜蛋白CPT1A是与脂滴相互作用的蛋白。免疫共沉淀进一步分析显示，PLIN2（而非PLIN3）与CPT1A结合，并且在葡萄糖缺乏的Huh7和LM3 HCC细胞中，这种结合显著增强。
②实验显示，添加糖酵解代谢产物到葡萄糖缺乏的细胞裂解液中，并未影响PLIN2与CPT1A的结合，表明PLIN2与CPT1A之间的相互作用不是由糖酵解代谢产物的减少引起的。此外，LC-MS/MS分析显示PFKL是与脂滴相关的蛋白。免疫印迹分析显示，葡萄糖缺乏增强了PFKL与PLIN2的结合，免疫荧光显示PFKL在葡萄糖缺乏时与PLIN2共定位。此外，耗尽PFKL抑制了葡萄糖缺乏诱导的PLIN2和CPT1A之间的结合、脂滴与线粒体之间的结合以及总脂滴数量的减少。
③使用不同的抑制剂处理HCC，发现仅p38抑制剂显著减少葡萄糖缺乏诱导的PFKL与PLIN2之间的相互作用。质谱分析显示，p38在Thr331位点磷酸化PFKL，但Thr331突变为丙氨酸（T331A）可取消p38介导的PFKL磷酸化。PFKL的Thr331磷酸化会导致其四聚体结构不稳定，从而降低PFKL的代谢活性。此外，PFKL还能磷酸化PLIN2的Ser159位点。表明，p38介导的PFKL Thr331磷酸化在葡萄糖饥饿条件下调节PFKL与PLIN2的相互作用及其代谢活性。
02PFKL的激酶活性与PLIN2的磷酸化
①GST下拉实验，发现经PFKL磷酸化的野生型PLIN2能够与CPT1A结合，而PLIN2(S159A)则不能。此外，在葡萄糖缺乏时，PLIN2(S159A)的表达降低了与CPT1A的结合，阻止了脂滴与线粒体的对接，并减少了荧光标记的脂肪酸从脂滴到线粒体的运输，而PLIN2(S159D)相反。表明，p38磷酸化的PFKL通过磷酸化PLIN2 Ser159，促进了PLIN2与CPT1A的关联，以及脂滴与线粒体的对接和脂肪酸的线粒体转运。
②研究发现，p38-PFKL-PLIN2-CPT1A轴触发的脂滴消失独立于自噬。ATGL在脂滴-线粒体对接区域积累，PLIN2 Ser159的磷酸化减少了其与ATGL的结合，增加了脂滴膜对ATGL的暴露，从而促进了脂滴的消耗。β-氧化率测定表明，PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化在能量应激下促进了肝癌细胞中的β-氧化。
03PFKL-PLIN2信号轴在肿瘤生物学中的作用
①研究显示，葡萄糖缺乏会提升HCC的凋亡率，而2-DG（一种糖酵解抑制剂）处理则减少了细胞增殖。使用CPT1A的抑制剂或rPLIN2(S159A)和rPFKL(T331A)会加重葡萄糖缺乏对细胞凋亡的影响及2-DG对细胞增殖的抑制效果。然而，补充短链和中链脂肪酸能够显著恢复这些细胞的存活。
②在裸鼠模型中，腹腔和皮下注射rPLIN2、rPFKL的Huh7细胞能够抑制肿瘤生长，减少肿瘤体积和重量，并且伴随着PLIN2 Ser159和PFKL Thr331磷酸化的减少、脂滴积累的增加、细胞死亡的增强和Ki67表达的降低。而腹腔注射2-DG抑制肿瘤细胞糖酵解，减少了脂滴数量，抑制肿瘤生长，增加了PLIN2 Ser159和PFKL Thr331的磷酸化。将rPLIN2或rPFKL的表达与2-DG处理相结合，能够进一步抑制肿瘤生长，减少脂质消耗和肿瘤组织中的Ki67表达。
③将HCC及临近正常组织进行免疫组化染色，结果显示，HCC标本中的PFKL Thr331和PLIN2 Ser159的磷酸化水平显著增加。通过Cancer Proteogenomic Data Analysis Site的数据分析，发现PLIN2 Ser159在人类肝癌标本中的磷酸化和上调。且PFKL Thr331磷酸化和PLIN2 Ser159磷酸化水平与HCC患者的较差生存率正相关。表明，p38介导的PFKL磷酸化及其随后介导的PLIN2磷酸化在人类HCC的临床侵袭性中发挥关键作用。
图1. PFKL是PLIN2和CPT1A之间的相互作用、脂滴-线粒体拴系和脂滴脂肪分解所必需的
图2. PFKL充当蛋白激酶并磷酸化 PLIN2 Ser159
图3. PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进了PLIN2和CPT1A之间的相互作用、脂滴-线粒体拴系和β氧化
图4. PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化促进HCC细胞的存活和增殖以及肿瘤生长
图5. PFKL介导的PLIN2 Ser159磷酸化与人HCC的临床侵袭性相关
结论与讨论
本文研究发现，糖酵解酶PFKL在葡萄糖缺乏时通过磷酸化PLIN2，促进脂滴与线粒体的结合，增强β-氧化过程，从而支持肿瘤细胞在能量应激下的存活和增殖。
然而，尽管已揭示PFKL在肿瘤代谢中的作用，但PFKL的非传统功能及其在肿瘤发展中的具体机制仍需进一步研究。未来的研究可以探索PFKL的其他底物和调控因子，以及其在不同类型肿瘤中的表达和功能差异。