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清华大学王晓东院士团队发27.7分cell子刊，揭秘ZnT1在铜离子吸收与铜诱导细胞死亡中的作用
Highlights
1. ZnT1作为铜死亡所需的Cu2+导入物发挥作用
2. Zn2+竞争性抑制ZnT1介导的Cu2+摄取
3. ZnT1独特的亚基间二硫键有助于Cu2+的高效传输
4. 肠道ZnT1缺失导致铜缺乏和Lgr5+干细胞损伤
近日，“Cell Metabolism”（IF=27.7）上发表了一篇“Zinc transporter 1 functions in copper uptake and cuproptosis”的文章。这篇文章通过一系列实验研究发现，锌转运蛋白1不仅能够将锌从细胞内运输到细胞外，还具有将铜运输进细胞的功能，并且这一功能对于铜诱导的细胞死亡—即铜死亡是必需的。
研究背景介绍
锌离子转运蛋白（ZnT1），属于SLC30家族成员，主要功能是将锌离子从细胞质基质运输到细胞外或细胞内囊泡中。
铜死亡是一种特殊的细胞死亡形式，与铜离子的过量积累有关，通过铜离子直接结合到线粒体上的脂酰化成分，导致铁硫蛋白簇的聚集和不稳定。
研究思路分析
研究技术路线图
01ZnT1的功能发现与铜离子运输
①在HeLa细胞中进行全基因组CRISPR-Cas9筛选。发现，硫酸铜本身可剂量依赖性地诱导HeLa细胞死亡。通过感染全基因组靶向的gRNA病毒并反复用0.5 mM CuSO4处理HeLa细胞四天，富集了对铜死亡有抗性的细胞。经过PCR扩增gRNA并进行下一代测序，比较处理与未处理对照组的gRNA丰度，发现SLC30A1/ZnT1基因是丰度最高的基因。在HeLa细胞中特异性删除ZnT1基因，细胞对Cu2+触发的铜死亡产生抗性。而在ZnT1基因敲除细胞中异位表达ZnT1，则恢复了这些细胞对铜死亡的敏感性。
②研究发现，ZnT1基因敲除细胞中Zn2+含量高于恢复ZnT1表达的细胞。ZnT1敲除细胞对Zn2+过载敏感，而ZnT1的异位表达能拯救这些细胞。ICP-MS测量发现，ZnT1 KO细胞中的铜含量与过表达ZnT1的细胞相比显著降低，而其他金属元素如铁和锰含量保持不变。
③尽管CTR1的是铜离子转运蛋白，但在CTR1 KO细胞中铜离子浓度与野生型（WT）HeLa细胞相似。而CTR1在ZnT1敲除细胞中的异位表达恢复了铜死亡，表明ZnT1和CTR1在Cu2+摄入方面功能上存在冗余。
④研究还发现DMT1在ZnT1 KO细胞中过表达不能支持铜死亡，且ZnT10过表达在ZnT1 KO细胞中经过Cu2+处理后不能诱导铜死亡，表明Cu2+运输活性并非ZnT家族的普遍特性，且ZnT1诱导的铜死亡不依赖于其Zn2+运输活性。
02ZnT1的结构特征与铜锌离子的结合
①为深入了解ZnT1如何运输Cu2+和Zn2+，使用冷冻电镜技术（cryo-EM）解析了ZnT1在无金属结合态（apo）、Cu2+结合态和Zn2+结合态的结构。结果显示，ZnT1在无金属结合态和Zn2+结合态的结构非常相似，都呈现向外开放的构象，便于离子结合。
②ZnT1具有一个独特的富含半胱氨酸的细胞外结构域，包括一个亚单位间和两个亚单位内的二硫键。结构显示ZnT1在细胞质域（CTD）和跨膜域（TMD）中存在几个Zn2+结合位点，这些位点对于蛋白质折叠和Zn2+运输可能具有重要作用。在Zn2+存在下，ZnT1的His富含环和CTD共同协调额外的Zn2+离子。这些发现为ZnT1如何运输Cu2+和Zn2+提供了结构基础。
③实验发现，Zn2+处理能够以剂量依赖的方式阻止Cu2+诱导的细胞死亡。在ZnT1基因敲除细胞中重新表达ZnT1后，Zn2+的存在显著降低了细胞内铜水平并阻止了铜诱导的细胞死亡。然而，在敲除ZnT1的细胞中表达CTR1时，Zn2+对铜水平和细胞死亡的影响不大。这表明Zn2+抑制ZnT1介导的铜诱导细胞死亡的效果，并不是由于细胞内锌的积累。
④此外，当ZnT1的某些关键氨基酸残基发生突变时，这些突变体细胞能够在Cu2+处理下存活。特别是，D47或H251的突变几乎完全消除了ZnT1的铜运输活性。而涉及其他锌结合位点的突变对ZnT1的铜运输活性影响不大。表明，Zn2+和Cu2+在TMD中共享相同的主要结合位点，对Zn2+和Cu2+的运输都至关重要。
03ZnT1的运输机制与体内功能验证
①ZnT1因其独特的同源二聚体结构和胞外富含半胱氨酸的环成为唯一能介导Cu2+进入细胞的ZnT家族成员。ZnT1的二聚体结构由一个亚单位间二硫键稳定，而其他ZnT家族成员缺乏这种结构。ZnT1的胞外结构域和跨膜域之间存在更紧密的相互作用，这有利于Cu2+的招募和转运。Cu2+结合后，ZnT1会发生构象变化，从而促进Cu2+从胞外环境进入胞质。相比之下，Zn2+的转运则依赖于His富含环的组氨酸残基从胞质中捕获Zn2+，并将其传递到ZnT1的初级结合位点。这些发现揭示了ZnT1在调控Zn2+和Cu2+运输中的独特作用机制。
②通过肠上皮特异性ZnT1敲除小鼠（ZnT1IEC-KO）模型验证ZnT1在体内运输Cu2+的能力。结果显示，ZnT1IEC-KO小鼠肠道器官培养物中ZnT1的mRNA水平显著降低。在CuSO4处理后，ZnT1敲除的肠道器官培养物的细胞存活率明显高于对照组，表明ZnT1在肠道上皮细胞中可能影响Cu的摄取和铜死亡。然而，ZnT1敲除小鼠体重显著下降，并在20天内死亡，这表明ZnT1在维持小鼠生存中起着关键作用。直接注射ZnCl2可以挽救ZnT1IEC-KO小鼠的体重下降和死亡。
③此外，ZnT1IEC-KO小鼠肠道上皮中的Lgr5+干细胞数量减少了一半，表明ZnT1的缺失可能影响肠道干细胞的增殖。通过ICP-MS检测发现，ZnT1IEC-KO小鼠肠道上皮细胞和血清中Cu的浓度降低，而Zn2+的浓度在血清中减半，这表明ZnT1负责从血清中摄取Cu以维持肠道上皮细胞中适当的Cu水平。
图1.锌转运蛋白1通过转运Cu2+介导铜诱导的细胞死亡
图2. ZnT1在无金属结合态和锌离子结合态下的冷冻电镜结构
图3. ZnT1的亚单位间二硫键稳定了向外开放的构象并促进了Cu2+的运输
图4. ZnT1介导的Cu2+和Zn2+运输的模型
图5. ZnT1基因敲除诱导肠道干细胞丢失
图6. ZnT1缺失在低铜饮食条件下引起严重的肠道上皮缺陷
图7. Abstract
结论与讨论
本文揭示了ZnT1具有运输Cu2+的新功能，这对于铜诱导的细胞死亡铜死亡至关重要。研究发现ZnT1的二硫键结构使其能够高效地运输Cu2+，且Zn2+与Cu2+在ZnT1中共享相同的结合位点。
尽管ZnT1的铜运输活性已被证实，但其在不同组织中的功能作用及在整体铜稳态中的重要性仍需进一步研究。未来研究将探索ZnT1在铜代谢疾病中的作用机制，以及如何利用ZnT1调节铜水平以治疗相关疾病。此外，研究人员也计划深入研究ZnT1的结构特性，以更全面地理解其在铜和锌离子运输中的作用。