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江苏大学发27.7分SCI，揭秘N2型肿瘤相关中性粒细胞外泌体通过特定miRNA调控胃癌转移
Highlights
1. N2型中性粒细胞外泌体中的特定miRNAs能够促进胃癌转移。
2. 胃癌细胞能通过外泌体改变中性粒细胞的代谢，增加这些miRNAs的表达。
3. miRNAs在胃癌患者血清中表达升高，有成为生物标志物的潜力。
近日，“Molecular Cancer”（IF=27.7）上发表了一篇题为“Exosomal miR-4745-5p/3911 from N2-polarized tumor-associated neutrophils promotes gastric cancer metastasis by regulating SLIT2”的文章。这篇文章探讨了肿瘤微环境中N2型肿瘤相关中性粒细胞（TANs）来源的外泌体在胃癌转移中的作用。
研究背景介绍
N2肿瘤相关中性粒细胞（N2-TANs）是肿瘤微环境中的一种特殊类型的中性粒细胞，它们通过肿瘤源性因子的作用被极化为N2表型，与N1型相比，N2型TANs表现出促进肿瘤生长、转移、血管生成、治疗抵抗和免疫抑制的活性。
狭缝引导配体2（SLIT2）是slit指导蛋白家族的一员，它在细胞迁移和肿瘤转移中起着抑制作用。
研究思路分析
研究技术路线图
01外泌体的功能和miRNA的作用
①使用N2-TANs释放的外泌体（N2-Exo）处理胃癌细胞，并以N2-CM（N2-TANs培养基）及其去除外泌体的N2-CM作为对照组。验证了胃癌细胞对外泌体的摄取。实验结果显示，N2-Exo与N2-CM一样，N2-Exo处理显著增强了胃癌细胞的迁移和侵袭能力，而去除外泌体的N2-CM影响较小。此外，N2-Exo处理还增强了胃癌细胞的肿瘤球形成能力，并上调了间充质标记物和干性基因的表达。表明，N2极化中性粒细胞通过其外泌体促进了胃癌细胞的转移潜力和干性。
②建立了胃癌肺转移模型，通过尾静脉注射稳定转染荧光素酶报告基因的HGC27细胞至裸鼠。结果显示，N2-Exo显著增强了小鼠肺部的生物发光信号强度，H&E染色进一步证实了N2-Exo组小鼠肺部转移灶数量的增加，且这些小鼠的生存时间显著缩短。此外，通过类似方法建立的小鼠腹膜转移模型也显示，N2-Exo增加了小鼠腹膜内的生物发光信号强度和肠道组织中的转移肿瘤结节数量。表明，N2-Exo促进了胃癌的转移，并导致了预后不良。
③对N2-Exo进行了RNA测序，发现其富含miRNAs，特别是miR-4745-5p和miR-3911。通过qRT-PCR验证了这些miRNA在N2-TANs中的上调表达，并在N2-Exo处理的胃癌细胞中观察到这些miRNAs表达的增加。实验通过将标记有Cy3的miR-4745-5p和miR-3911模拟物转染到中性粒细胞中，并与胃癌细胞共培养，证实了N2-Exo能够直接将这些miRNAs传递给胃癌细胞。表明N2-Exo可以通过直接传递miR-4745-5p和miR-3911来影响胃癌细胞。
02miRNA的调控机制和靶基因
①研究发现miR-4745-5p和miR-3911的过表达促进了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而敲低这些miRNAs则减弱了这些能力。无论是体外还是体内实验，敲低这些miRNAs都显著减弱了N2-Exo促进胃癌细胞转移的能力。此外，体内肺转移模型证实，敲低这些miRNAs的N2-Exo处理的小鼠肺部转移灶的数量和强度显著降低。表明miR-4745-5p和miR-3911是N2-Exo促进胃癌转移的关键因素。
②使用生物信息学方法预测了miR-4745-5p和miR-3911的潜在下游靶基因，确定了与癌症转移相关的SLIT2基因。实验证实，这两种miRNAs的过表达抑制了胃癌细胞中SLIT2的mRNA和蛋白表达，而敲低则增强了其表达。荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-4745-5p和miR-3911的过表达抑制了野生型SLIT2报告基因的荧光素酶活性，而突变型则不受影响，表明SLIT2是这两种miRNAs的直接靶标。
③使用N2-Exo处理胃癌细胞，发现SLIT2的表达显著下调，而其他潜在靶基因的表达变化很小，这表明N2-Exo对SLIT2的调控是特异性的。在胃癌细胞中同时敲低miR-4745-5p或miR-3911能够抵消N2-Exo处理对SLIT2的抑制作用。荧光素酶报告基因实验显示N2-Exo处理降低了野生型SLIT2报告基因的活性，但不改变突变型，说明N2-Exo通过miR-4745-5p和miR-3911调控SLIT2。
④通过用收集自CAF、HUVEC和N2极化中性粒细胞的外泌体处理HGC27和MGC803细胞，发现只有N2-Exo能够降低胃癌细胞中SLIT2蛋白水平。随后进行了救援实验，使用腺病毒介导的SLIT2转染胃癌细胞，发现N2-Exo促进胃癌细胞转移的能力被显著减弱。体内小鼠肺转移模型也证实了这一点，N2-Exo处理的小鼠肺转移信号强度和转移灶数量显著高于Ad-SLIT2处理组。表明，N2-TANs通过外泌体miR-4745-5p/miR-3911介导的SLIT2表达调控促进胃癌转移。
03代谢重编程和临床意义
①研究发现胃癌细胞来源的外泌体（GC-Exo）显著上调了中性粒细胞中糖酵解基因的表达，并通过HMGB1介导了这一效应。此外，GC-Exo还激活了中性粒细胞的戊糖磷酸途径，并通过NF-κB信号通路诱导糖酵解基因的上调。这些变化导致miR-4745-5p和miR-3911在N2-TANs中的表达增加，且这种增加依赖于糖酵解。研究表明GC-Exo诱导的N2-TANs通过促进胃癌细胞的迁移和侵袭来影响肿瘤进展，这一过程可以通过抑制糖酵解来减弱。
②研究发现，发生转移的胃癌患者肿瘤组织中浸润性中性粒细胞数量更多，SLIT2表达水平更低。此外，miR-4745-5p和miR-3911在胃癌组织中的表达水平比正常组织高，并且与SLIT2的表达水平呈负相关。研究还发现，胃癌患者的低密度中性粒细胞比高密度中性粒细胞表达更高水平的miR-4745-5p和miR-3911。
③通过收集健康对照组、良性胃病患者和胃癌患者的血清样本并分离其中的外泌体，发现胃癌组中这两种miRNA的表达水平升高。利用ddPCR技术检测这些miRNA，结果显示胃癌患者血清中N2-TANs来源的外泌体miRNA表达水平更高，表明这些miRNA可能作为胃癌的潜在生物标志物。
图1. N2极化中性粒细胞通过外泌体促进胃癌细胞的转移潜力和干性。
图2. N2极化中性粒细胞衍生的外泌体在体内促进胃癌转移。
图3. N2极化中性粒细胞衍生的外泌体将miR-4745-5p和miR-3911递送至胃癌细胞。
图4. N2极化中性粒细胞衍生的外泌体通过外泌体miR-4745-5p/3911促进胃癌转移。
图5. SLIT2是胃癌细胞中miR-4745-5p和miR-3911的常见靶点。
图6. N2极化中性粒细胞衍生的外泌体通过调节SLIT2促进胃癌转移
图7. 胃癌细胞衍生的外泌体诱导N2极化中性粒细胞中miR-4745-5p和miR-3911的糖酵解依赖性上调。
图8. 在胃癌患者来源的N2极化中性粒细胞来源的外泌体中，miR-4745-5p和miR-3911的循环水平升高。
图9. Abstract
结论与讨论
研究发现，N2-TANs通过其来源的外泌体传递miR-4745-5p和miR-3911，这些miRNA能够下调胃癌细胞中的SLIT2表达，从而促进胃癌的转移。此外，胃癌细胞能够诱导中性粒细胞的N2极化和代谢重编程，进而影响miRNA的表达。在胃癌患者的血清样本中，这些miRNA的水平升高，显示出作为胃癌诊断生物标志物的潜力。
未来的研究可以进一步探索N2-TANs在外泌体介导的肿瘤促进作用中的具体机制，以及如何通过靶向这些miRNA或其调控途径来干预胃癌的转移。此外，研究者建议进行更大规模的临床样本研究，以验证这些miRNA作为胃癌早期诊断和预后评估生物标志物的有效性和可靠性。还有潜力研究这些miRNA在其他类型癌症中的作用，以及它们在肿瘤微环境中的更广泛影响。