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Cell子刊 | 天津医科大学重磅研究：脑缺血引发全身性Notch1信号激活，促进动脉粥样硬化进展
Highlight
1. 中风诱导外周内皮细胞持续活化和衰老
2. 循环Notch1配体在脑缺血后激活外周内皮细胞
3. 内皮细胞中的Notch1过度激活增强了髓系细胞的粘附
4. 卒中后动脉粥样硬化进展涉及Notch1诱导的内皮细胞中VCAM1表达
近日，“Immunity”（IF=25.5）上发表了一篇题为“Brain ischemia causes systemic Notch1 activity in endothelial cells to drive atherosclerosis”的文章。这篇文章研究了脑缺血后全身性血管内皮细胞中Notch1信号通路的激活如何导致动脉粥样硬化的发展。
研究背景介绍
Notch信号通路是一种细胞间通讯机制，广泛存在于多种生物中，对细胞命运决定、增殖和分化等过程有重要影响。Notch1是该通路中的一个关键受体，其异常激活与多种疾病的发生发展有关。
血管内皮细胞(ECs)是血管内壁的主要成分，它们不仅形成血管的内衬，还参与调节血管的通透性、血液凝固和血管新生等生理过程。
VCAM1是一种细胞粘附分子，主要表达在血管内皮细胞表面，参与白细胞与血管内皮的粘附过程，是炎症反应和免疫细胞迁移到炎症部位的关键介质。
研究思路分析
研究技术路线图
01脑缺血对血管内皮细胞的影响
①通过分析中国第三次国家脑卒中登记（CNSR-III）的数据，发现脑卒中幸存者在发病后前3个月内，由大动脉粥样硬化、心源性栓塞和小血管闭塞引起的脑卒中复发率分别为9.7%、7.8%和4.5%。表明大动脉粥样硬化是卒中复发的主要原因。
②利用微正电子发射断层扫描和计算机断层扫描技术，发现短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠的主动脉在脑卒中后18F-氟脱氧葡萄糖（FDG）摄取增加，表明大动脉细胞活性增强。此外，还发现MCAO小鼠大动脉上的中性粒细胞和单核细胞粘附增加，这种现象至少持续到发病后28天。
③scRNA-seq分析发现，脑缺血后大动脉ECs发生了显著且持续的变化，包括VCAM1表达增加和细胞衰老标志物的增加，这表明脑卒中导致远端ECs的持续激活和衰老。
④对三个内皮细胞簇进行单细胞分析，这些EC簇被分为9种状态。其中EC1、EC3和EC6的MCAO小鼠中的比例高于对照组。这些细胞状态在细胞粘附、细胞迁移、衰老、血管发育和伤口愈合等途径上表达丰富，表明它们对脑卒中发作有响应。特别地，这些脑卒中诱导的基因映射到参与血管形态发生、应对氧化应激和ERK1/ERK2级联正向调控的途径。
⑤研究发现，无论细胞簇或状态如何，脑缺血后ECs在细胞迁移、衰老和细胞粘附途径上均富集，这些途径一致涉及Notch1，且在脑缺血后在ECs中持续上调。流式细胞术分析也显示，脑卒中小鼠主动脉ECs中Notch1受体的上调，以及其激活形式NICD1的表达增加。表明，脑缺血在外周诱导了持续的EC Notch1激活，暗示血管ECs在脑卒中期间的激活和衰老可能涉及Notch1信号通路。
02循环Notch1配体与血管内皮细胞的相互作用
①研究发现，脑缺血后，循环外泌体中DLL1和Jagged1的表达增加，这些外泌体主要来源于P2RY12+CX3CR1+髓系细胞。在脑卒中小鼠和患者中，这些外泌体的增加与外周ECs中Notch1的激活和细胞衰老标志物的增加相关。此外，使用缺乏小胶质细胞DLL1和Jagged1的小鼠模型，发现这些小鼠循环中的DLL1+或Jagged1+外泌体减少，周围ECs的Notch1激活也减弱。
②此外，使用外泌体释放抑制剂GW4869减少了MCAO小鼠循环中外泌体中DLL1和Jagged1的表达，并降低了外周ECs的激活和衰老。共培养实验表明，来自P2RY12+CX3CR1+细胞的外泌体可以直接与主动脉ECs结合，导致Notch1、VCAM1以及衰老标志物P16和P53的上调。表明，脑缺血后，P2RY12+CX3CR1+细胞来源的DLL1+或Jagged1+外泌体释放到外周，有助于ECs中Notch1的激活。
③通过共培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与脑卒中患者或对照组的循环外泌体，发现脑卒中患者的循环外泌体能够与HUVECs结合，并导致Notch1、粘附分子VCAM1以及衰老标志物P16和P53 mRNA的上调。而使用抗Notch1单克隆抗体（mAb）阻断Notch1信号，发现能够消除循环外泌体引起的Notch1、VCAM1、P16和P53 mRNA的增加。
④此外，通过共培养THP-1细胞与经脑卒中患者循环外泌体处理的HUVECs，发现THP-1细胞对HUVECs的粘附增加，而这种增加可通过抗Notch1 mAb或抗VCAM1 mAb处理来消除。表明，脑卒中患者的循环外泌体足以诱导EC中Notch1的激活和衰老。
03治疗策略的探索
①从MCAO和再灌注后第3天开始，对野生型小鼠进行了为期两周的抗VCAM1 mAb或IgG对照治疗。流式细胞术分析显示，抗VCAM1 mAb减少了脑缺血引起的主动脉组织中Ly6Chigh单核细胞和中性粒细胞的增加。
②MCAO在易患动脉粥样硬化的载脂蛋白E缺陷（apoE-/-）小鼠中诱导了动脉粥样硬化斑块的增多和病变部位单核细胞的积累，而VCAM1阻断减少了这些变化，同时增加了胶原含量和α-SMA阳性区域。VCAM1阻断并未改变MCAO或假手术处理的apoE-/-小鼠的循环甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平。抗VCAM1 mAb治疗并未显著改变MCAO小鼠的脑损伤体积。此外，高脂饮食单独处理并未显著改变MCAO小鼠或假手术对照组ECs中Notch1、VCAM1、P16和P53的表达。表明，VCAM1在脑卒中诱导的动脉粥样硬化进展中是必要的。
③培育Tie2Cre-Notch1fl/-和Notch1fl/-小鼠模型探究ECs Notch1信号对血管炎症的影响。发现，MCAO Tie2Cre-Notch1fl/fl小鼠中ECs的VCAM1、P16和P53表达减少，同时主动脉组织中浸润的Ly6Chigh单核细胞和中性粒细胞也减少。
④培育Tie2Cre-Notch1fl/-apoE-/-和Notch1fl/fl-apoE-/-小鼠评估破坏内皮Notch1信号对脑卒中诱导的动脉粥样硬化斑块生长和血管炎症的影响。并在MCAO手术前四周开始给予高脂饮食。结果显示，与Notch1fl/-apoE-/-小鼠相比，Tie2Cre-Notch1fl/-apoE-/-小鼠在卒中后的动脉粥样硬化斑块减少，单核细胞和油红O阳性区域减少，胶原蛋白含量相似，而且这种效应在假手术组与MCAO组之间没有显著差异。
⑤此外，还发现破坏小胶质细胞DLL1和Jagged1可以减少脑卒中诱导的动脉粥样硬化斑块生长和血管炎症。使用GW4869可以减少脑卒中诱导的动脉粥样硬化斑块生长。发现抗Notch1 mAb可以抑制脑卒中诱导的主动脉组织中浸润的Ly6Chigh单核细胞和中性粒细胞的增加，以及抑制动脉粥样硬化斑块的生长。表明阻断ECs中的Notch1信号可以抑制卒中后的动脉粥样硬化进展。
图1. 脑缺血诱导外周ECs的持续激活和衰老
图2. 脑缺血诱导外周EC Notch1的持续激活
图3. 脑缺血后循环中Notch1配体的持续增加
图4. 缺血性卒中患者循环中的外泌体诱导内皮Notch1激活和细胞衰老
图5. VCAM1阻断抑制了卒中诱导的动脉粥样硬化进展
图6. 内皮Notch1的破坏减轻了卒中诱导的动脉粥样硬化进展
图7. Notch1阻断减轻了卒中诱导的动脉粥样硬化进展
图8.abstract
结论与讨论
本研究表明，脑缺血能够通过循环外泌体中的Notch1配体激活远端血管内皮细胞的Notch1信号通路，导致VCAM1表达上调和细胞衰老，进而促进动脉粥样硬化的发展。通过使用抗Notch1或抗VCAM1抗体，或者通过基因编辑技术敲除Notch1，可以有效减轻卒中后的血管炎症和动脉粥样硬化进展，为卒中的治疗提供了新的策略。
未来关于Notch1配体的确切来源、其在不同血管床中的作用以及与卒中后全身炎症反应的交互作用仍需进一步研究。此外，需要在更大的患者群体中验证这些发现，并探索这些治疗策略的长期效果和安全性，以及它们是否可能与其他治疗手段联合使用，以实现更好的治疗效果。