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STTT | 浙江大学联合西湖大学揭秘肝癌耐药性全新分子机制：p-MYH9/USP22/HIF-1α轴的关键调控作用
Highlights
1. p-MYH9 (Ser1943) 通过招募USP22去泛素化酶来稳定HIF-1α
2. 使用CK2抑制剂CX-4945和USP22抑制剂S02，逆转了肝癌细胞的耐药性
近日，“Signal Transduction and Targeted Therapy”（IF=40.8）上发表了一篇题为“The p-MYH9/USP22/HIF-1α axis promotes lenvatinib resistance and cancer stemness in hepatocellular carcinoma”的文章。这篇文章深入探讨了肝癌细胞对靶向药物乐伐替尼产生耐药性的分子机制，并寻找逆转耐药性的潜在治疗策略。
研究背景介绍
乐伐替尼是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂。它通过抑制血管内皮生长因子受体（VEGFRs）、成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）等靶点，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。
癌症干细胞特性指的是某些癌细胞具有类似干细胞的能力，包括自我更新、多向分化和肿瘤形成等。这些特性使得癌细胞能够抵抗治疗、复发和转移，是癌症治疗中的一个重大挑战。
HIF-1α是一种转录因子，通常在低氧条件下稳定并激活，调控多种与细胞代谢、血管生成、细胞存活和增殖相关的基因
研究思路分析
研究技术路线图
01耐药性和癌症干细胞特性的表征
①对Hep-3B、HuH-7和SNU-387细胞建立HCC的乐伐替尼耐药（LR）细胞模型。LR细胞系的半抑制浓度（IC50）显著提高，且在裸鼠模型中，使用HuH-7和HuH-7-LR细胞移植瘤实验显示，耐药细胞对乐伐替尼的治疗反应降低。
②此外，研究还发现与原始细胞相比，LR细胞系的迁移能力增强，形成的肝球数量更多、体积更大，并且干细胞标记物的mRNA表达上调。体内实验也证实了HuH-7-LR细胞的肿瘤生成能力增强，并且计算出HuH-7-LR细胞的干细胞频率远高于HuH-7细胞。表明LR细胞系显示出增加的癌症干细胞特性。
③对获得性HCC LR细胞进行RNA测序，发现HIF-1α为中心的转录途径显著激活。已知HIF-1α途径在糖酵解和癌症干细胞特性中起关键作用，因此测试糖酵解能力，发现HuH-7-LR和SNU-387-LR细胞的胞外酸化率（ECAR）更高，且LR细胞中糖酵解相关基因的mRNA水平升高。敲减HIF-1α有效降低了迁移能力、体外自我更新能力和干细胞标记物的mRNA表达。
④当HCC亲本细胞和LR细胞在乐伐替尼处理下进行HIF-1α敲减实验时，结果显示HIF-1α敲减显著提高了HCC LR细胞对乐伐替尼的敏感性，而在亲本细胞中没有显著差异。表明HIF-1α途径的激活促进了肝癌的癌症干细胞特性和耐药性。
02分子机制探索
①研究发现，MYH9是HIF-1α潜在的相互作用蛋白。MYH9能够与HIF-1α结合并稳定其蛋白水平，防止其通过泛素化和蛋白酶体途径降解。在HCC LR细胞中，MYH9敲减降低了HIF-1α蛋白水平，抑制了其转录活性，并增加了其对乐伐替尼的敏感性。MYH9敲减还抑制了克隆形成、迁移、肝球形成、干细胞标记物和糖酵解相关基因的表达。相反，MYH9过表达则促进了这些癌症干细胞特性。表明MYH9通过稳定HIF-1α蛋白，促进了HCC的耐药性、糖酵解和癌症干细胞特性。
②研究重点关注了MYH9的Ser1916和Ser1943这两个常见的磷酸化位点。通过构建S1916E和S1943E突变体，发现MYH9的Ser1943磷酸化比Ser1916磷酸化对HIF-1α蛋白的上调作用更显著。在HCC LR细胞中，Ser1943磷酸化的MYH9表达增加。
③此外，S1943A突变体（模拟非磷酸化形式）与HIF-1α的结合能力较弱，而S1943E突变体具有更强的去泛素化HIF-1α蛋白的能力。此外，野生型MYH9和MYH9-S1943E突变体对突变HIF-1α（P402, P564）的降解没有影响。表明，p-MYH9 (Ser1943)在HIF-1α蛋白的去泛素化调节中起主导作用。
03治疗靶点和临床意义
①研究推测p-MYH9 (Ser1943)可能是逆转耐药性和抑制癌症干细胞特性的有效靶点。在11种肝癌细胞系中，p-MYH9 (Ser1943)的表达水平与对乐伐替尼的IC50值呈强正相关。在患者来源的肝癌模型中，p-MYH9 (Ser1943)表达低的模型对乐伐替尼更敏感。
②研究发现CK2抑制剂CX-4945能有效抑制p-MYH9 (Ser1943)和HIF-1α的表达及HIF-1α的转录活性。CX-4945抑制了肝癌LR细胞的肝球形成、迁移和干细胞标记物的mRNA表达，并与乐伐替尼联合使用显示出协同抑制克隆形成和增殖的效果。体内实验也表明，CX-4945能增强肝癌LR细胞对乐伐替尼的敏感性并抑制移植瘤的生长。进一步证明了p-MYH9 (Ser1943)介导的HIF-1α稳定性调节了肝癌LR细胞的癌症干细胞特性。
③对肝癌和正常邻近肿瘤组织中p-MYH9 (Ser1943)的表达检测发现，肝癌中p-MYH9 (Ser1943)的水平显著上调。生存分析显示，p-MYH9 (Ser1943)表达水平较高的患者总体生存率和无疾病复发存活期较差。此外，对肝癌样本中的p-MYH9 (Ser1943)和HIF-1α蛋白表达进行了评估，结果显示两者之间存在强正相关，进一步确认了这两种蛋白之间的关系。
④研究推测p-MYH9 (Ser1943)可能通过招募去泛素化酶USP22来去泛素化并稳定HIF-1α。首先证明了在肝癌亲本细胞或耐药细胞中USP22敲减可以消除MYH9诱导的HIF-1α上调，并促进HIF-1α的泛素化介导降解。
⑤此外，发现在HEK-293T细胞中，MYH9，尤其是MYH9-S1943E，可以与USP22相互作用，而MYH9-S1943A则不能。这表明p-MYH9 (Ser1943)可以特异性地招募USP22去泛素化HIF-1α。而USP22敲减或抑制有效地增强了肝癌耐药细胞和原代肝癌细胞对乐伐替尼的敏感性。表明，p-MYH9 (Ser1943)可以招募USP22去泛素化HIF-1α并促进耐药性。
图1. 获得性乐伐替尼耐药HCC细胞显示癌症干性增加。
图2. HIF-1α通路激活是HCC获得性LR和癌症干性增加的原因。
图3. 鉴定MYH9为HIF-1α相互作用蛋白以及MYH9对HIF-1α蛋白稳定和泛素化的影响。
图4. MYH9促进HCC的LR和癌症干性。具有MYH9敲低（shMYH9）或shNC的HCC LR细胞。
图5. 在Ser1943位点磷酸化的MYH9与HIF-1α相互作用并促进HCC的LR和干性。
图6. p-MYH9（Ser1943）是干性和LR的治疗靶点，可预测HCC患者的不良预后和LR。
图7. p-MYH9（Ser1943）募集USP22以去泛素化HIF-1α并促进LR
结论与讨论
研究发现，肝癌细胞中p-MYH9 (Ser1943)/USP22/HIF-1α信号轴的激活是导致乐伐替尼耐药性和癌症干细胞特性增加的关键因素。通过抑制该轴，可以逆转耐药性并抑制癌症干细胞特性，为肝癌治疗提供了新的潜在靶点。临床样本分析也证实了p-MYH9 (Ser1943)的表达水平与肝癌患者的预后和耐药性密切相关，表明其作为生物标志物的潜力。
未来的研究可以集中在开发更特异的抑制剂，以及在临床试验中评估这些靶点抑制剂与现有治疗联合使用的效果和安全性。此外，深入理解该信号轴在不同肝癌亚型中的作用差异，将有助于实现更精准的个体化治疗策略。