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复旦大学science子刊最新研究：肿瘤相关巨噬细胞上NOD1激活增强肝癌中CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫
Highlights
1. NOD1的激活可以促使TAMs增强CD8+T细胞的激活
2. NOD1激活剂与抗PD-1抗体联合使用在肿瘤模型中显示出更强的抗肿瘤效果
3. NOD1激活通过调节脂肪酸代谢影响TAMs的免疫功能
近日，“Science Advances”（IF=11.7）上发表了一篇题为“Activation of NOD1 on tumor-associated macrophages augments CD8+ T cell–mediated antitumor immunity in hepatocellular carcinoma”的文章。这篇文章探讨了在肝细胞癌中，NOD1在肿瘤相关巨噬细胞上的激活如何增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。
研究背景介绍
NOD1是NOD样受体（NLR）家族中的一员，主要在细胞质中发挥作用，能够识别细菌的肽聚糖分子模式，激活下游的炎症反应和免疫应答。
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境中的一种免疫细胞，通常与肿瘤的免疫抑制和促进肿瘤生长有关。TAMs通常表现出M2型免疫抑制表型，但可以通过某些机制被重新编程为M1型免疫激活表型。
PLIN5是一种与脂滴相关的蛋白质，参与调节脂质的储存和代谢。在肿瘤微环境中，PLIN5可能通过影响TAMs的代谢状态，进而影响其功能。
研究思路分析
研究技术路线图
01基础表达与相关性研究
①通过分析TCGA-LIHC和GEO数据库中的RNA测序数据，研究发现NOD1在TAMs中的表达与M1型巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的浸润正相关，并与HCC患者的更好预后相关。通过多重免疫荧光实验和流式细胞术分析，证实了NOD1主要与CD68+TAMs共定位，且HCC中NOD1+TAMs的表达显著高于其他免疫细胞。
②此外，高NOD1+TAMs浸润的HCC患者表现出更高比例的激活CD8+T细胞，而与其他免疫细胞类型的浸润无显著差异。NOD1+TAM水平高的患者与更好的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）相关。
③将骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）用肝癌细胞的条件培养基处理来模拟TAMs，并用NOD1激活剂C12-iE-DAP处理这些细胞。发现C12-iE-DAP处理增加了免疫刺激性基因的表达，减少了TAMs的免疫抑制基因表达。当与脾脏CD8+T细胞共培养时，它们表现出了更强的激活CD8+T细胞的能力，包括促进T细胞的增殖和增加细胞毒性效应分子IFN-γ的产生。这一免疫激活效应在NOD1缺失的巨噬细胞中被消除，表明这一效应依赖于NOD1。
02体内作用机制研究
①建立了小鼠的原位和皮下HCC模型，发现，NOD1激活剂C12-iE-DAP能够显著抑制肿瘤生长，而这种效应可被NOD1抑制剂ML130取消。通过单细胞RNA测序，观察到C12-iE-DAP处理后肿瘤中T细胞浸润增加，特别是效应CD8+T细胞，并伴随着免疫刺激性基因表达的上升。
②此外，NOD1激活的TAMs显示出更强的促炎活性。重要的是，清除巨噬细胞或CD8+T细胞会消除C12-iE-DAP的抗肿瘤效果，而在免疫缺陷小鼠中C12-iE-DAP处理也没有显示出抗肿瘤效果。表明，NOD1的激活通过促进巨噬细胞和CD8+T细胞的抗肿瘤活性来抑制肝癌的生长。
③通过对HCC患者的单细胞RNA测序数据分析发现，NOD1与脂肪酸氧化（FAO）相关通路呈显著负相关。代谢组学分析发现，经NOD1激活剂C12-iE-DAP处理的TAMs表现出游离脂肪酸（FFA）水平的升高和β-氧化率的降低，这些效应在NOD1缺失的小鼠TAMs中不存在。
④进一步研究发现，NOD1的激活通过降低PLIN5和PPARα的表达来破坏TAMs的FAO。过表达PLIN5可以逆转C12-iE-DAP诱导的FAO破坏和FFA积累。此外，研究还表明PLIN5介导了NOD1诱导的TAMs免疫刺激性表型。NOD1激活导致RIPK2和p38的磷酸化，进而负向调节PPARα。使用p38 MAPK抑制剂SB203580可以逆转NOD1激活剂对PPARα和PLIN5表达的下调。
03临床相关性和治疗潜力
①代谢组学分析显示，C12-iE-DAP处理的TAMs中饱和脂肪酸（如十三酸、肉豆蔻酸和棕榈酸）水平显著升高。而棕榈酸能显著增强TAMs促进CD8+T细胞激活的能力。棕榈酸的增加促进了TAMs上OX40L共刺激分子的表达，并通过直接的细胞间接触依赖方式激活了CD8+T细胞。此外，NOD1激活通过增加OX40L的棕榈酰化，促进其在细胞膜上的定位，进一步激活CD8+T细胞。这一效应可以通过OX40L中和抗体抵消，证实了OX40L在NOD1诱导的免疫刺激性表型中的关键作用。
②在小鼠的皮下肝癌模型中，研究发现，NOD1激活剂C12-iE-DAP与抗PD-1抗体的联合使用比单独使用抗PD-1抗体更有效地抑制了肿瘤生长。此外，NOD1激活可以增强抗PD-1治疗的效果。肠道微生物组数据分析显示，抗PD-1治疗有效的患者体内乳酸菌的丰度较高，而使用新霉素抑制这些菌或缺乏NOD1的情况下，抗PD-1的疗效降低。相反，给予乳酸菌LGG可以增强HCC对抗PD-1治疗的响应，尤其在NOD1存在时。表明，NOD1激活可能通过调节肠道微生物组和增强免疫细胞的活性来提高免疫检查点抑制剂的疗效。
③从49名接受抗PD-1治疗的肝癌患者中收集了肿瘤标本。多重免疫荧光分析显示，抗PD-1治疗后的肝癌患者中，NOD1+TAMs水平高的患者CD8+T细胞的浸润显著增加。此外，具有NOD1高表达、PLIN5低表达和OX40L高表达的TAMs的肝癌患者对抗PD-1治疗反应最好，生存结果也最为理想。
图1. NOD1+ TAM的浸润与HCC CD8+T细胞的激活和生存改善相关。
图2. NOD1的激活诱导TAMs获得能够支持CD8+T细胞反应的免疫刺激性表型
图3. 体内巨噬细胞NOD1的激活通过增强CD8+T细胞免疫延缓HCC的进展
图4. NOD1的激活通过降低PLIN5的表达来调节TAMs中的FAO和免疫刺激性功能
图5. NOD1-PLIN5诱导的棕榈酸水平升高促进巨噬细胞OX40L膜定位并激活CD8+T细胞
图6. NOD1的激活增强了抗PD-1治疗的疗效
图7. TAMs中活化的NOD1/PLIN5/OX40L轴与接受抗PD-1治疗的HCC患者的临床结果改善正相关
结论与讨论
本研究发现NOD1激活能够显著提高TAMs的免疫刺激性表型，增强CD8+T细胞的抗肿瘤活性，从而抑制HCC的生长。NOD1激活剂C12-iE-DAP与抗PD-1抗体联合使用，在多种肿瘤模型中显示出比单独使用抗PD-1抗体更强的抗肿瘤效果。此外，NOD1的激活通过调节TAMs中的脂肪酸代谢，特别是通过PLIN5和OX40L途径，促进了T细胞的激活。
此外，需要研究NOD1激活对肿瘤微环境其他免疫细胞的影响，以及如何优化NOD1激活剂的体内递送。未来的临床研究应该探索NOD1激活与免疫检查点抑制剂联合使用在癌症治疗中的效果和安全性，以及如何根据患者的肠道微生物组特征来个性化治疗方案。