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ACS Nano | 南京大学研究：靶向肿瘤外泌体的双重纳米抗体递送系统助力肿瘤免疫治疗
Highlights
1. 创建了一种新型的工程益生菌系统，用于肿瘤微环境中的精准药物递送。
2. 利用抗PD-L1和抗CD9纳米抗体的组合，同时攻击肿瘤的免疫逃逸和转移能力。
3. 通过近红外光控制的细菌裂解，实现了在肿瘤特定区域的定时药物释放。
近日，“ACS Nano”（IF=15.8）上发表了一篇题为“Spatiotemporal Delivery of Dual Nanobodies by Engineered Probiotics to Reverse Tumor Immunosuppression via Targeting Tumor-Derived Exosomes”的文章。这篇文章报道了一种创新的肿瘤免疫治疗方法，利用工程化益生菌（Escherichia coli Nissle 1917，EcN）共表达抗PD-L1和抗CD9纳米抗体（EcN-Nb），并将其与锌基金属有机框架（ZIF-8CHO）结合，装载靛青绿（ICG）形成EcN-Nb-ZIF-8CHO-ICG（ENZC），实现对细菌的时空调控裂解，以进行免疫治疗。
研究背景介绍
肿瘤衍生外泌体（TDEs）是肿瘤细胞释放的外泌体，参与肿瘤免疫逃逸、促进肿瘤生长和转移。TDEs表面常表达免疫抑制分子如PD-L1，可以远距离抑制免疫系统。
金属有机框架（MOFs）是一类具有高比表面积和可调节孔隙结构的材料，由金属离子或团簇与有机配体组成。在生物医学领域，MOFs可用于药物递送系统，通过封装药物分子并响应特定刺激来控制药物释放。
纳米抗体是一类源自骆驼科动物（如骆驼和羊驼）的重链抗体片段，仅包含一个重链可变区域（VHH），而没有轻链。这些单域抗体因其小尺寸、高稳定性和易生产性而在生物医学研究中受到重视。
研究思路分析
研究技术路线图
01设计与合成
①抗CD9纳米抗体4C8在人体中显示出高亲和力，研究验证了它也能在小鼠细胞中与CD9抗原结合。将编码该纳米抗体和抗PD-L1的基因转入大肠杆菌，成功表达这两种纳米抗体。实验结果表明，4C8也能在小鼠细胞上发挥作用，表明其可能在抗癌治疗中有效。经纯化后的纳米抗体在体外实验中能有效阻断相应抗原，对Hela细胞和4T1乳腺癌细胞表现出抑制效果，提示了它们在体内靶向治疗中的潜力。
②利用微流控芯片技术合成了新型的锌基金属有机框架(ZIF-8CHO)，成功装载了光敏剂ICG，并修饰在工程化大肠杆菌表面形成EcN-ZIF-8CHO-ICG。这种结构不仅尺寸均匀、稳定性好，而且能在酸性环境下响应性释放ICG，显示出较高的封装效率和药物载药量。此外，ICG在封装后的荧光性质未受影响，表明其在不同环境中保持稳定。
02体外实验与特性分析
①研究发现EcN-ZIF-8CHO-ICG在近红外辐射下展现出良好的光热特性，能够有效裂解细菌并释放抗CD9和抗PD-L1纳米抗体。实验证实，在适当的NIR辐射条件下，这种复合体系可以高效生成ROS，并在乳腺癌细胞中显示出显著的细胞毒性。此外，该系统在没有辐射的情况下对细胞无毒性，表明其在肿瘤治疗中具有潜在的应用价值。
②ENZC在模拟体内环境的PBS缓冲液中孵育，随后与4T1细胞共培养并用NIR照射，以释放纳米抗体。研究发现，经NIR处理后，ENZC释放的抗CD9纳米抗体显著抑制了肿瘤细胞的创伤愈合和迁移能力。
③此外，研究还显示，经ENZC处理后，人微血管内皮细胞HMEC-1和L929小鼠成纤维细胞对DiO标记的外泌体的摄取减少，而小鼠巨噬细胞RAW264.7的摄取却增加。表明，ENZC释放的抗CD9纳米抗体能够与TDEs相互作用，减少它们在正常细胞中的摄取，同时促进巨噬细胞的清除作用。
03体内实验与治疗效果评估
①EcN能够自主迁移到肿瘤环境，主要是因为它们能够逃避免疫清除和对低氧区域的趋化性。此外，EcN与适应性免疫系统的直接相互作用和减少炎症的能力使其具有良好的生物相容性。通过体内实验，验证了ENZC系统在静脉注射后的肿瘤定位能力，发现其荧光信号在肿瘤部位显著增强，且具有强大的光热效应，能够在近红外光照射下迅速提高肿瘤温度，表明ENZC系统在肿瘤治疗中具有良好的应用前景和生物安全性。
②在4T1乳腺癌小鼠模型中评估ENZC的治疗潜力，结果显示，ENZC+NIR处理组小鼠的肿瘤重量和尺寸最小，其中部分肿瘤被完全消除。细胞凋亡和免疫反应的检测结果表明，ENZC+NIR治疗促进了T细胞的活化和巨噬细胞从M2型向M1型的极化，增强了抗肿瘤免疫反应。此外，治疗还提高了小鼠的存活率，证明了ENZC系统在体内的稳定性和生物相容性，具有显著的抗肿瘤效果和较低的副作用。
③进一步研究该系统联合NIR能否抑制肿瘤转移的生长。结果显示，ENZC+NIR治疗组在原发肿瘤体积和重量上显示出显著的抗肿瘤效果，并且显著抑制了肺转移，肺部的转移灶数量极少。
④此外，该治疗组在移植肿瘤中观察到效应T细胞显著增加，以及CD86+至CD206+巨噬细胞比例的提高，表明治疗能有效促使巨噬细胞向M1表型极化，增强巨噬细胞的吞噬作用和T细胞的激活。免疫荧光染色显示，ENZC+NIR治疗组中CD8+ IFN-γ+和CXCL13细胞的数量显著增加，说明ENZC系统能显著提高CD8+T细胞的激活/杀伤状态，并逆转抗PD-L1耐药状态。系统给药ENZC未在小鼠中引起严重副作用，尽管治疗初期体重有所下降，但随后恢复正常。
⑤监测了小鼠乳腺癌模型中TDEs的体内分布，研究发现，ENZC+NIR治疗能显著减少循环中的TDEs，降低肺和肿瘤部位的外泌体积累，并增加肝脏和脾脏中外泌体的清除。这表明ENZC释放的抗CD9纳米抗体能够通过刺激脾脏和肝脏中的巨噬细胞活性，减少肿瘤细胞衍生的外泌体，从而抑制肿瘤转移。
图1.图1. EcN-ZIF-8CHO-ICG的合成与表征
图2. 体外细菌裂解与近红外激活的细胞毒性
图3. 近红外辐射下从ENZC释放的抗CD9纳米抗体的体外抗侵袭和迁移活性
图4. ENZC的体内生物分布和肿瘤靶向能力
图5. ENZC的体内光热和免疫治疗效果
图6. ENZC联合靶向肿瘤外泌体和免疫疗法抑制肿瘤转移
图7. Abstract
结论与讨论
本研究成功构建了一种新型的工程益生菌系统，通过共表达抗PD-L1和抗CD9纳米抗体，并利用MOF和NIR触发的细菌裂解技术，实现了肿瘤微环境中纳米抗体的时空控制释放。实验结果表明，该系统能够有效抑制肿瘤生长和转移，并通过重塑肿瘤微环境，激活抗肿瘤免疫反应，显示出良好的治疗效果和临床应用潜力。
未来研究需要进一步探索该系统的长期稳定性和安全性，以及在更广泛的肿瘤模型和临床试验中的有效性。此外，研究人员提出需要优化纳米抗体的亲和力和靶向性，以及探索与其他治疗手段的联合应用可能性，以提高治疗效果。还有，降低可能的免疫原性和不良反应也是未来研究的重点。