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武汉大学发14.3分SCI，揭秘糖尿病肾病中线粒体损伤的分子机制
Highlights
1. RBBP6通过促进ERR𝛼的K48链接泛素化，导致ERR𝛼在DKD中的降解，从而加剧线粒体损伤。
2. 沉默RBBP6或突变ERR𝛼的K100位点能够减轻线粒体损伤并改善DKD模型的肾功能。
近日，“Advanced Science”（IF=14.3）上发表了一篇题为“RBBP6-Mediated ERRα Degradation Contributes to Mitochondrial Injury in Renal Tubular Cells in Diabetic Kidney Disease”的文章。这篇文章研究了糖尿病肾病中，ERRα的表达下调及其调控机制，以及这一过程对近曲小管细胞线粒体损伤的影响。
研究背景介绍
糖尿病肾病（DKD）是糖尿病的一种严重并发症，主要影响肾脏的功能。它是导致终末期肾病的主要原因之一。DKD的发病机制复杂，涉及多种因素，其中包括近曲小管细胞（PTCs）中的线粒体功能障碍。
雌激素相关受体α（ERRα）是一种孤儿核受体，在线粒体功能的调控中扮演重要角色。在肾脏、肝脏和骨骼肌等代谢活跃的组织中ERRα表达丰富，尤其在肾脏近曲小管细胞中，ERRα对维持肾脏的生理功能至关重要。
研究思路分析
研究技术路线图
01ERR𝛼的表达与线粒体损伤
①在DKD患者中，通过多种染色技术发现肾脏组织有显著病理变化，如系膜细胞增殖、糖原和胶原蛋白纤维沉积增加、基底膜增厚。这些发现强调线粒体损伤在DKD发病中起关键作用。ERR𝛼主要表达在PTCs的细胞核中，在DKD患者中ERR𝛼的表达降低。ERR𝛼的表达与肾功能标志物呈正相关，与尿白蛋白-肌酐比（ACR）呈负相关，表明其在DKD中的重要作用。
②使用两种糖尿病模型：16周龄的db/db小鼠模型和通过腹腔注射链脲佐菌素诱导的模型。这两个模型都显示出肾脏组织中ERR𝛼表达的显著降低。进一步对db/db和db/m小鼠的肾小管进行mRNA测序，发现与线粒体生物发生和结构相关的170多个基因的表达受到了显著抑制，特别是PGC1𝛼和TOM20。Western blot实验也证实线粒体相关蛋白，包括PGC1𝛼、TOM20和氧化磷酸化系统的成分都出现了明显的减少。
③对细胞进行了细胞活力实验（CCK-8）和高葡萄糖（HG）浓度梯度处理。结果证实，高血糖刺激的PTCs显示出ERR𝛼蛋白水平的降低和线粒体功能相关蛋白表达的抑制。使用针对ERR𝛼的siRNA减少了PTCs中的氧气消耗率，表明线粒体功能受损。
02ERR𝛼的保护作用与RBBP6的功能
①为了阐明ERR𝛼在DKD中PTCs的保护作用，通过将ERR𝛼floxed小鼠(ERR𝛼fl/fl)与Ggt1-Cre小鼠杂交，成功地将ERR𝛼特异性地引入PTCs中，并通过透射电子显微镜（TEM）和免疫金标记进行验证。这些ERR𝛼ptKI小鼠表现出正常表型，符合预期的孟德尔比率，表明遗传工程方法的有效性。
②深入检查发现，ERR𝛼ptKI小鼠PTCs中ERR𝛼的表达显著增加，几乎是对照组的两倍。DKD状态下ERR𝛼ptKI小鼠肾功能指标得到显著改善，肾小管萎缩和肾小管间质纤维化减少，线粒体功能增强。通过免疫荧光和TEM观察到，DKD状态下ERR𝛼ptKI小鼠的线粒体损伤减轻。表明，ERR𝛼在维持PTCs线粒体完整性中起着关键作用，并可能成为治疗DKD的新策略。
③利用慢病毒转导技术在HK-2细胞中过表达了ERR𝛼，以评估其对高血糖诱导的线粒体损伤的保护潜力。结果显示，过表达ERR𝛼能够显著恢复高血糖条件下减少的线粒体相关蛋白，如TOM20、PGC1𝛼和OXPHOS蛋白，增强线粒体结构和功能，并提高线粒体的呼吸能力和ATP生成。此外，透射电子显微镜分析显示，ERR𝛼过表达减少了高血糖引起的线粒体损伤。表明，ERR𝛼在保护肾脏细胞免受高血糖诱导的线粒体损伤中起着关键作用。
④研究发现，在DKD影响的PTCs中，ERR𝛼蛋白水平特定降低，但ERR𝛼的mRNA水平未变，表明这种降低是后转录调控的结果。免疫组化分析显示，db/db小鼠肾脏组织中泛素化总体水平上升，暗示在高糖条件下，泛素-蛋白酶体系统（UPS）参与了ERR𝛼的降解。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理高糖环境下的HK-2细胞，可以稳定ERR𝛼，证实了UPS在ERR𝛼降解中的作用。利用UbiBrowser生物信息学平台，发现RBBP6和STUB1是关键调节因子，其中RBBP6对ERR𝛼降解的影响更为显著。
03RBBP6的调控作用与治疗潜力
①通过空间转录组学和单核RNA测序数据，发现在DKD条件下，PTCs中RBBP6 mRNA显著富集且表达升高。此外，DKD患者样本中RBBP6和ERR𝛼的共定位研究显示，随着RBBP6的增加，ERR𝛼在PTCs中减少。表明，RBBP6的上调可能是DKD进展中PTCs线粒体损伤的潜在驱动因素。
②通过使用腺相关病毒来沉默RBBP6表达，发现这可以显著改善DKD小鼠模型的肾功能，并减少肾小管萎缩和纤维化。此外，沉默RBBP6还减少了线粒体损伤，增加了线粒体相关基因的表达。在体外实验中，沉默RBBP6提高了ERR𝛼蛋白水平，而过表达RBBP6则降低了ERR𝛼水平，这些变化可以通过蛋白酶体抑制剂MG132逆转。ERR𝛼激动剂DK3也有助于保持线粒体健康。
③实验发现，在HK-2细胞中RBBP6的siRNA可以显著抑制ERR𝛼的泛素化，而过表达RBBP6则增强了ERR𝛼的泛素化。研究还发现，RBBP6主要通过促进K48链接的泛素化，而非K63链接，来指导ERR𝛼向蛋白酶体降解。通过BDM-PUB数据库预测和突变分析，确定了ERR𝛼上K100残基对其泛素化至关重要，尤其是在高糖条件下。在PTCs和HK-2细胞中，ERR𝛼K100位点的突变可以恢复线粒体的完整性。
④此外，使用CRISPR/Cas9技术在体内模型中突变ERR𝛼的K100位点，能够逆转ERR𝛼的降解，并显著减轻线粒体损伤，改善肾功能。表明，RBBP6在调节糖尿病条件下的线粒体损伤中起着核心作用，为糖尿病肾病的治疗提供了新靶点。
图1. 糖尿病肾病中的肾脏病理变化和ERR𝛼表达
图2. ERR𝛼在糖尿病动物模型中下调并与线粒体功能相关
图3. 在近曲小管细胞中条件性敲入ERR𝛼可改善糖尿病肾病中的线粒体损伤
图4. RBBP6通过泛素-蛋白酶体系统介导ERR𝛼的降解
图5. 糖尿病肾病中RBBP6的表达上调
图6. RBBP6的下调可以减轻病理损伤并改善线粒体损伤
图7. RBBP6的下调改善HK-2细胞的线粒体损伤
图8. RBBP6促进ERR𝛼K100残基的K48链接泛素化
图9. 糖尿病肾病中ERR𝛼的下调和线粒体功能受损
结论与讨论
本研究发现RBBP6通过促进ERR𝛼的K48链接泛素化，导致ERR𝛼在糖尿病肾病中的泛素-蛋白酶体系统降解，从而加剧线粒体损伤。通过沉默RBBP6或突变ERR𝛼的K100位点，能够减轻线粒体损伤并改善肾功能，揭示了RBBP6-ERR𝛼轴作为糖尿病肾病治疗的潜在靶点。
未来的研究需要进一步探索RBBP6在糖尿病肾病中的作用机制，包括其如何被高血糖激活以及如何影响ERR𝛼的稳定性。此外，还需要研究RBBP6-ERR𝛼轴在其他类型的肾脏疾病中的作用，以及如何通过药物干预这一轴来保护线粒体功能和延缓糖尿病肾病的进展。