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突破性进展！第四军医大学发现CAR-M细胞沉默SIRPα增强实体瘤治疗效果
Highlights
1. SIRPα沉默增强CAR-M细胞抗肿瘤能力
2. 改造的CAR-M细胞在抗实体瘤方面表现出显著增强的疗效
3. SIRPα的沉默促进了炎症因子的产生和T细胞的肿瘤浸润，从而提升整体的抗肿瘤免疫反应
近日，“Cellular & Molecular Immunology”（IF=21.8）上发表了一篇题为“Silencing of SIRPα enhances the antitumor efficacy of CAR-M in solid tumors”的文章。这篇文章探讨了通过沉默SIRPα来增强嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）在实体瘤中的抗肿瘤效果。
研究背景介绍
信号调节蛋白α（SIRPα）是一种细胞表面蛋白，它通过与CD47结合来调节巨噬细胞的吞噬作用。在许多癌细胞中，CD47的过表达使得它们能够通过SIRPα途径逃避巨噬细胞的吞噬。SIRPα的沉默或阻断是增强巨噬细胞抗肿瘤活性的潜在策略。
嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）是一种基因工程化的巨噬细胞，通过嵌合抗原受体（CAR）技术使巨噬细胞能够特异性识别并攻击癌细胞。这种技术通常涉及将识别特定肿瘤抗原的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）与细胞内信号域融合，使巨噬细胞能够直接杀死肿瘤细胞。
研究思路分析
研究技术路线图
01巨噬细胞工程与功能验证
①为提高CAR的吞噬功能，通过将靶向HER2的scFv（P1h3）与含有免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）的FcγRI（FcεRIγ）、FcγRIIa和FcγRIIc的跨膜和胞内结构域融合，构建了新的受体。将这些重组CAR序列插入到慢病毒载体，并将其导入到优化了分化条件的THP-1细胞中，发现P1h3-FcγRIIa巨噬细胞展现出最强的肿瘤细胞吞噬能力。此外，通过在慢病毒载体中加入靶向SIRPα的shRNA，进一步提高了这些CAR修饰巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性，有效抑制了CD47-SIRPα信号。
②对相关巨噬细胞进行表型鉴定，结果显示，静息时CAR及CAR-shSIRPα巨噬细胞表达了更高水平的CD80、CD86和TNF-α。与SKOV3细胞共培养后，CAR修饰巨噬细胞表现出M1样极化标志物的显著增加。CAR-shSIRPα巨噬细胞在静息状态和抗原刺激状态下均表现出最低的CD163和CD206表达水平，并且分泌IL-1β、IFN-γ和TNF-α的能力最强。表明，CAR修饰的巨噬细胞表现出抗肿瘤的M1样极化表型，且抑制SIRPα进一步增强了它们呈递抗原和分泌促炎细胞因子的能力。
③研究CAR修饰的巨噬细胞对HER2阳性肿瘤细胞的吞噬作用，发现SKOV3细胞HER2表达最高，而DLD-1细胞HER2含量低。通过慢病毒将截短HER2引入癌细胞，使CAR巨噬细胞能特异性地吞噬HER2阳性细胞。实验显示，CAR-shSIRPα-M巨噬细胞对HER2阳性细胞的吞噬和杀伤能力更强。此外，对CD19阳性淋巴瘤细胞的实验也表明，敲减SIRPα增强了巨噬细胞的吞噬作用。表明CAR修饰巨噬细胞在体外对HER2阳性肿瘤细胞有良好抗肿瘤效果。
02抗肿瘤活性的机制研究
①患者来源的类器官（PDOs）能更准确地呈现肿瘤表型和特征。免疫组化证实构建的PDOs中HER2和CA199肿瘤抗原同时表达。将巨噬细胞与PDOs共培养，发现CAR修饰巨噬细胞能黏附并有效吞噬肿瘤细胞，导致肿瘤细胞凋亡并破坏PDO结构，尤其是CAR-shSIRPα处理的巨噬细胞对HER2阳性PDOs的破坏作用更显著。此外，共培养介质中的IL-1β和TNF-α水平升高，以CAR-shSIRPα巨噬细胞中的浓度最高。
②转录组测序数据的GO分析显示，与CAR巨噬细胞相比，CAR-shSIRPα巨噬细胞进一步富集与炎症反应等相关基因。KEGG和GSEA显示，CAR修饰巨噬细胞主要富集在炎症信号通路，CAR-shSIRPα巨噬细胞则富集与细胞因子等相关的信号通路。
③此外，这些巨噬细胞M1促炎基因和糖酵解相关基因表达有变化，CAR-shSIRPα处理的更明显，乳酸分泌也呈现类似规律，且与重组HER2蛋白共孵育影响糖酵解酶表达，提示可能通过糖酵解增强M1表型。研究发现，与肿瘤细胞共孵育后cGAS-STING信号通路相关转录因子在CAR修饰巨噬细胞中上调，SIRPα抑制的更明显，STING抑制剂H-151可降低CAR修饰巨噬细胞对肿瘤细胞的毒性及IFN-β分泌。此外，CAR修饰巨噬细胞转录分析显示ROS和超氧化物代谢通路富集，相关基因表达变化及与肿瘤共孵育后NO相关变化可为非吞噬依赖性细胞毒活性提供解释。
03疗效验证与免疫调节作用
①通过在裸鼠中建立多种肿瘤模型来评估CAR修饰巨噬细胞的体内疗效。在腹膜内肿瘤模型中，与PBS和UTD对照组相比，Ad-CAR组（通过腺病毒感染产生）和Lenti-CAR组（通过慢病毒感染产生）治疗组显示出显著的肿瘤生长抑制，Lenti-CAR治疗效果略优于Ad-CAR。在皮下肿瘤模型中，CAR-M和CAR-shSIRPα-M均能显著抑制肿瘤生长，尤其是CAR-shSIRPα-M展现出最佳治疗效果。
②免疫组化分析显示，CAR修饰巨噬细胞治疗组肿瘤组织中Ki67和CD31的表达降低，凋亡细胞增多。此外，CAR-shSIRPα巨噬细胞在体内维持了M1极化状态。在肺转移模型中，CAR-shSIRPα巨噬细胞治疗组几乎无肿瘤转移。表明CAR巨噬细胞在体内具有有利的治疗效果，且通过抑制SIRPα表达可进一步增强其疗效。
③通过将人外周血单个核细胞（hu-PBMCs）注入NCG小鼠，建立了人类免疫系统（HIS）小鼠模型。在HER2阳性肿瘤的HIS小鼠中，CAR修饰巨噬细胞治疗显著抑制了肿瘤生长，CAR-shSIRPα治疗组效果最好。治疗后的肿瘤组织中T细胞浸润增加，Ki67表达减少，凋亡细胞增多。在小鼠iBMDM细胞系中构建的CAR修饰巨噬细胞在B16-HER2肿瘤模型中也显示出治疗效果，促进了T细胞在肿瘤中的浸润。
图1. FcγRIIa结构域增强了CAR介导的肿瘤吞噬作用
图2. CAR-shSIRPα处理的巨噬细胞表现出增强的M1样极化表型
图3. CAR-shSIRPα巨噬细胞展现出增强的肿瘤吞噬作用和细胞毒性
图4. CAR修饰的巨噬细胞有效根除肿瘤患者源性类器官
图5. CAR-shSIRPα巨噬细胞中炎症信号增强、cGAS-STING途径激活以及ROS和NO产生
图6. CAR-shSIRPα巨噬细胞在体内展现出强大的抗肿瘤活性
图7. CAR-shSIRPα巨噬细胞促进T细胞浸润和抗肿瘤免疫
结论与讨论
本研究通过CAR-M沉默SIRPα，显著增强了对HER2阳性实体瘤的抗肿瘤效果。改造后的CAR-M细胞表现出M1样巨噬细胞表型，具有增强的吞噬功能和细胞毒性，能有效消除肿瘤细胞和患者源性类器官。此外，这些细胞在体内外实验中促进了T细胞的肿瘤浸润，增强了抗肿瘤免疫反应。
然而，未来研究需要进一步探索CAR-M细胞在增强抗原呈递、促进记忆T细胞反应以及调节肿瘤微环境方面的潜力。此外，研究者们提出，需要进行更多的研究来优化CAR-M细胞的制备流程，提高其在体内的持久性和分布，以及评估其长期的安全性和疗效，为临床应用奠定基础。