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南京医科大学重磅研究：GJB2在肝细胞癌中对肿瘤糖酵解和免疫逃逸的调控作用
Highlights
1. GJB2在HCC细胞中高表达，并从细胞膜转移到细胞质和核内，与肿瘤恶性表型相关。
2. GJB2通过激活NF-κB和HIF-1α/GLUT-1/PD-L1通路，促进HCC细胞糖酵解和免疫逃逸。
3.丹酚酸B能抑制GJB2，减少HCC进展，并增强抗PD-1治疗效果。
近日，“Advanced Science”（IF=14.3）上发表了一篇题为“GJB2 Promotes HCC Progression by Activating Glycolysis Through Cytoplasmic Translocation and Generating a Suppressive Tumor Microenvironment Based on Single Cell RNA Sequencing”的文章。这篇文章通过单细胞RNA测序技术探讨了GJB2在肝细胞癌中的作用及其潜在的分子机制。
研究背景介绍
GJB2是一种连接蛋白，参与细胞间的间隙连接，允许小分子和离子在细胞间传递，影响细胞间的通讯。在肿瘤生物学中，GJB2的异常表达和定位可能与肿瘤的进展和免疫逃逸有关。
丹酚酸B是从中药丹参中提取的一种活性成分，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种生物活性。
研究思路分析
研究技术路线图01GJB2的表达和定位
①通过单细胞RNA测序分析了肝细胞癌（HCC）中的细胞异质性，发现了七种不同的细胞群，包括B细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、恶性细胞、髓系细胞和NK/T细胞。CopyKAT软件分析，发现恶性细胞存在明显的染色体拷贝数变异（CNV）。此外，GJB2在恶性细胞中表达丰富，而在其他癌症如肝内胆管癌和结直肠癌中也有类似的富集现象，暗示其可能在肿瘤发展中起重要作用。
②进一步分析发现，GJB2的短外显子1在HCC中表达降低，表明GJB2在肝癌中倾向于失去外显子1的跨膜结构并进入细胞质。生存分析表明，低表达外显子1的GJB2与HCC患者预后较差相关。此外，研究发现与正常肝组织相比，肝癌细胞中的GJB2更倾向于位于细胞质和细胞核。
02GJB2的功能影响和机制探究
①研究发现敲减GJB2能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，突变GJB2的膜蛋白区域后，与野生型相比，突变组更能促进肝癌的进展，包括增殖、侵袭和迁移。
②研究发现敲减GJB2后差异表达的基因在炎症、蛋白质泛素化和NF-κB通路中显著富集。KEGG分析显示，CD8+T细胞耗竭、Hippo信号通路和缺氧通路明显涉及。代谢组学分析揭示了GJB2敲减后肝癌细胞中葡萄糖代谢物显著改变，差异代谢物主要涉及葡萄糖-丙氨酸循环、半乳糖代谢和谷胱甘肽代谢等通路。
③研究发现，敲减GJB2后，P65表达不变，而p-P65、HIF-1α和GLUT-1蛋白表达显著降低。ECAR实验表明，GJB2表达降低抑制了HCCLM3和Hep-3B细胞的糖酵解能力，乳酸产生、ATP水平和糖酵解消耗也随之下调。此外，由于NF-κB途径激活可增加PD-L1表达，且HIF-1α和GLUT-1诱导的肿瘤缺氧和炎症常介导肿瘤进展并导致PD-L1升高，研究发现GJB2敲减后，PD-L1的mRNA和蛋白表达也显著降低。
④研究发现，GJB2敲减后，NF-κB信号通路中的关键蛋白IKKα/β和p-IκBα的磷酸化水平降低，而IκBα蛋白水平升高。IκBα mRNA水平无变化，表明IκBα蛋白更稳定。GJB2敲减细胞的IκBα半衰期延长，提示GJB2与IκBα稳定性相关。研究还发现GJB2与ASB2蛋白相互作用，并促进IκBα泛素化，从而在肝癌中激活NF-κB途径。
03GJB2与肿瘤免疫微环境及药物治疗
①构建GJB2基因敲减小鼠，分析小鼠皮下肿瘤样本中CD45+免疫细胞。结果显示，GJB2敲减后，M2巨噬细胞、B细胞、树突状细胞和CD4+T细胞的相对比例降低，而单核细胞、M1巨噬细胞、CD8+T细胞和NK细胞的相对比例增加。
②此外，GJB2敲减组中CD45、CD86和TNF-α的表达增加。CD8+T细胞表面的ICOS、PD1、CTLA4、TIM3等常见标志物的表达也增加，表明GJB2缺乏可能导致肝癌中对免疫检查点抑制剂如PD1单克隆抗体更加敏感。
③首先通过sh-RNA在H22细胞中敲低GJB2的表达，并将其注射到小鼠皮下，对其中一组小鼠给予抗PD-1治疗。结果显示，GJB2敲减组与对照组相比，肿瘤体积和重量显著减少；而GJB2敲减联合抗PD-1治疗组与仅抗PD-1治疗组相比，肿瘤体积和重量进一步显著降低。
④对GJB2蛋白的活性位点进行筛选，选择丹酚酸B来进一步研究。通过药物结合的2D和3D模式分析，发现丹酚酸B的两个酚羟基分别与GJB2蛋白的THR5和THR26形成氢键。此外，丹酚酸B的羧基与GJB2蛋白的GLN7形成氢键。体外实验表明，丹酚酸B能够与GJB2蛋白结合，并且能够抑制NF-κB通路和肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在动物模型中，丹酚酸B联合抗PD-1治疗显著降低了肿瘤体积和重量。
图1. GJB2在scRNA-seq的肿瘤细胞中特异性富集
图2. GJB2失去了其膜段，主要位于HCC的细胞质中
图3. GJB2在体外促进了人类癌细胞的增殖、侵袭和迁移
图4. 肿瘤细胞中下调GJB2的RNA序列和代谢组学分析
图5. GJB2通过激活肿瘤细胞糖酵解来增加PD-L1
图6. GJB2通过募集ASB2促进IκBα泛素化，从而激活NF-κB通路
图7. GJB2缺陷重新连接了TME并激活了HCC中的免疫
图8. 抑制GJB2有利于增强癌症抗PD1治疗的有效性
图9. 丹酚酸B是一种靶向GJB2的小分子抑制剂，基于结构虚拟筛选可以减缓HCC进展
图10. Abstract
结论与讨论
本研究发现GJB2在HCC中表达异常，其mRNA和蛋白水平在肿瘤组织中升高，并与不良预后相关。GJB2的定位从细胞膜转移到细胞质和核中，可能通过激活NF-κB和糖酵解途径促进肿瘤进展。此外，GJB2的抑制或敲低能够重塑肿瘤微环境，提高对免疫检查点抑制剂的敏感性。丹酚酸B作为GJB2的小分子抑制剂，展现出抑制HCC进展的潜力。
尽管已揭示GJB2在HCC中的作用机制，但仍需进一步研究来探索GJB2在肿瘤发展中的具体角色。未来的研究可以集中在GJB2如何调节肿瘤微环境中的免疫细胞，以及如何优化丹酚酸B等小分子抑制剂的临床应用。