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ACS Nano | 浙江工业大学利用细菌外膜囊泡开发新型免疫细胞接合器，增强实体瘤免疫治疗
Highlights
1. 利用细菌外膜囊泡开发了一种新型的免疫细胞接合器。
2. OMV-NICE能有效招募并激活巨噬细胞和T细胞，抑制肿瘤生长。
3. 在小鼠模型中，OMV-NICE显著抑制肿瘤生长并延长生存期。
近日，“ACS Nano”（IF=15.8）上发表了一篇题为“Engineered Outer Membrane Vesicles as Nanosized Immune Cell Engagers for Enhanced Solid Tumor Immunotherapy”的文章。这篇文章提出了一种利用细菌外膜囊泡（OMVs）作为免疫细胞接合器（ICE）（OMV-NICE）的新型平台，以增强实体瘤的肿瘤免疫疗法。
研究背景介绍
外膜囊泡（OMVs）是革兰氏阴性细菌释放的天然细胞外囊泡，含有免疫刺激性分子，如脂多糖（LPS）、脂蛋白和肽聚糖。由于其纳米尺度、天然佐剂属性和灵活的操作性，OMVs已成为有价值的药物递送载体，能够封装多种药物或在表面结合药物。
免疫细胞接合器（ICE）是指一类能够招募和激活免疫细胞以杀死癌细胞的治疗实体。
研究思路分析
研究技术路线图
01OMVs与纳米抗体的制备和功能验证
①Probiotic Escherichia coli Nissle 1917(EcN)被选为产生OMVs的细菌，删除野生型EcN的msbB和OmpA基因得低毒高产囊泡菌株。用SpyCatcher-SpyTag化学法，将SpyCatcher003(SpC003)与OmpA在质粒中融合后转入突变株得OMV-SpC，经Western blot确认融合蛋白表达。选抗CD47的A4和抗PD-L1的5DXW-T61V纳米抗体，因A4可增强巨噬细胞吞噬，5DXW-T61V可激活T细胞。并生成二价和三价形式，在C端加SpT003与OMV-SpC表面SpC003反应，发现不同价数的纳米抗体能有效地共轭到OMVs上，且共轭量随比例增加而增加。
②通过流式细胞仪分析，发现OMVs上的纳米抗体保持活性，显著提高了OMVs对肿瘤细胞B16-F10的亲和力。实验显示，纳米抗体A4能增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，而纳米抗体5DXW-T61V能激活T细胞，增强对肿瘤细胞的细胞毒性。表明，纳米抗体的修饰增强了OMVs的肿瘤细胞亲和力和免疫细胞的活性，其中二价和三价纳米抗体的效果更为显著。
02OMV-NICE的构建和特性分析
①为生成能同时招募和激活巨噬细胞及T细胞的基于OMV的OMV-NICE，通过三种后功能化策略（融合蛋白修饰FPM、顺序修饰SM、随机修饰RM）将A2和D3共同安装到OMV表面。通过WB分析确认了三种策略都能使纳米抗体成功共轭到OMVs表面，但SM策略的共轭产量显著高于其他两种方法。此外，SM策略产生的OMV在巨噬细胞吞噬测试中显示出较其他策略更优的效果。故选择其用于进一步研究。
②在确立了双重修饰策略后，进一步评估了工程化OMVs的功能。研究发现，OMV-NICE仅对小鼠细胞有亲和力，而对人体细胞无亲和力。通过与B16-F10-GFP细胞共培养，发现OMV-NICE在每个时间点都显示出比OMV-SpC更高的亲和力，2小时后细胞表面的OMV-NICE几乎达到饱和，8小时后仍可在细胞表面观察到红色边缘，表明OMVs结构稳定。
③通过共聚焦显微镜分析，只有在OMV-NICE存在时，才能成功检测到更多的三色共定位信号，表明OMV-NICE具有“激活效应”。此外，OMV-SpC、未共轭的纳米抗体（Nbs）和OMV-NICE都能促进骨髓源树突状细胞成熟和巨噬细胞的极化。特别是，OMV-SpC和OMV-NICE更能促进M1型巨噬细胞的极化，这可能归因于OMVs固有的免疫佐剂特性。相比之下，单独用Nbs处理的细胞中观察到M2型巨噬细胞数量增加。最后，工程策略没有改变OMVs的形态和粒子大小。
03OMV-NICE的体内抗肿瘤效果和机制探究
①使用了B16-F10黑色素瘤小鼠模型评估OMV-NICE的体内抗肿瘤效果。结果显示，OMV-SpC、Nbs和OMV-NICE治疗组的肿瘤组织中IFN-γ和IL-6浓度显著增加，表明在肿瘤组织中引发了炎症反应。OMV-NICE在肿瘤组织中引起了更高的IFN-γ和IL-6积累。注射后小鼠体重没有显著下降，表明OMVs和Nbs具有良好的生物相容性。OMV-NICE治疗的小鼠肿瘤平均大小最小，显著延长了小鼠的中位生存期。而OMV-NICE和OMV-SpC治疗组的IFN-γ浓度高于Nbs治疗组，表明OMVs可能通过IFN-γ介导的抗肿瘤反应抑制肿瘤生长。
②流式细胞术分析显示，OMV-SpC和OMV-NICE处理的肿瘤组织中F4/80阳性细胞的比例显著增加，表明OMVs可能由于其天然佐剂特性而招募巨噬细胞。还发现OMV-SpC和OMV-NICE能显著增加肿瘤内M1极化巨噬细胞的比例，而Nbs单独治疗没有显著影响。此外，OMV-NICE治疗还增强了巨噬细胞的吞噬活性，表明其能通过阻断CD47/SIRPα途径来杀死癌细胞。
③通过测量CD3、CD4和CD8标记物评估肿瘤组织中T细胞的数量。结果显示，Nbs和OMV-NICE治疗显著增加了CD3阳性CD8阳性T细胞的比例，这可能归因于5DXW-T61V对PD-1/PD-L1相互作用的阻断。此外，OMV-NICE还显著增加了CD3阳性CD4阳性T细胞的比例，这表明OMV-NICE增强了辅助CTLs和巨噬细胞杀死和吞噬癌细胞的能力。进一步研究显示，OMV-NICE导致肿瘤细胞凋亡增加。
图1. 与纳米抗体共轭的OMVs的生成及特性分析
图2.肿瘤细胞、免疫细胞与OMVs之间的相互作用分析
图3. OMV-NICE的特性和免疫激活
图4. OMV-NICE在携带黑色素瘤小鼠中的治疗效果
图5. 在不同处理（PBS、OMV-SpC、Nbs和OMV-NICE）后肿瘤相关巨噬细胞的表征及其在体内的极化
图6. 在四种不同处理（PBS、OMV-SpC、Nbs和OMV-NICE）后体内肿瘤中T细胞的变化分析以及使用TUNEL染色的凋亡分析
图7. Abstract
结论与讨论
本研究开发的OMV-NICE平台通过共轭靶向CD47/SIRPα和PD-1/PD-L1途径的纳米抗体，显著增强了对实体瘤的免疫治疗效果。OMV-NICE能高效募集并激活巨噬细胞和T细胞，促进M1型巨噬细胞极化，增强吞噬作用和细胞毒性，从而抑制肿瘤生长。研究结果证实OMV-NICE作为一种新型免疫细胞接合器，在肿瘤免疫治疗中具有巨大潜力。
尽管OMV-NICE展现了良好的治疗效果和生物相容性，未来的研究需进一步优化纳米抗体的价数和共轭效率，以及探索OMVs的免疫佐剂属性对不同类型肿瘤的影响。此外，还需要深入研究OMV-NICE在多种肿瘤模型中的应用，并评估其长期的疗效和安全性，为临床转化提供更多科学依据。