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重庆大学发15.8分ACS Nano：生物矿化纳米药物激活癌症干细胞的铁死亡与免疫应答，开辟癌症治疗新路径
Highlights
1. 提出一种创新的纳米整合策略实现对癌症干细胞的靶向治疗。
2. 纳米单元能够有效抑制肿瘤细胞中STAT3信号通路，恢复CD8+T细胞的杀伤功能。
3. 通过CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元的治疗，能够改变肿瘤免疫微环境，促进了肿瘤的系统性和持久性排斥。
近日，“ACS Nano”（IF=15.8）上发表了一篇题为“Biomineralization-Tuned Nanounits Reprogram the Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Signaling for Ferroptosis-Immunotherapy in Cancer Stem Cells”的文章。这篇文章提出了一种针对癌症干细胞的纳米整合策略，通过时空控制的方式重新编程信号转导和转录激活因子3（STAT3）调控的信号通路，实现铁死亡-免疫疗法。
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研究背景介绍
癌症干细胞（CSCs）是肿瘤细胞中具有自我更新和多向分化潜能的亚群，它们与肿瘤的复发、转移和治疗抵抗性密切相关。CSCs在肿瘤微环境中具有独特的特性，能够抵抗常规的化疗和放疗。
STAT3是一种转录因子，参与细胞对多种信号的响应。在癌症中，STAT3的持续激活与肿瘤细胞的增殖、存活和免疫逃逸有关。STAT3的抑制被认为是一种有效的抗癌策略。
研究思路分析
研究技术路线图01纳米单元的合成与表征
①研究使用了肝癌相关的从Hepa1-6和HuH7细胞系中提取的CSCs作为模型。在对CSCs中铁死亡和免疫抗性的分子机制研究中，发现SLC7A11和SLC3A2的表达水平与CD133呈正相关，而GPX4和FSP1的表达水平则没有显著变化。CSCs中SLC7A11和SLC3A2的高表达与高GSH状态一致，而SOX2的高表达也在mRNA和蛋白水平上得到了验证。研究还发现，STAT3的磷酸化水平增强与PD-L1表达上调有关，这可能有助于CSCs的免疫逃逸。使用STAT3抑制剂尼可酰胺（Ni）处理CSCs可以显著降低STAT3的磷酸化，进而降低CD133、SOX2和PD-L1的表达，并上调促进铁死亡的ACSL4酶的表达。
②通过生物矿化方法开发了一种新型的无定形磷酸钙（ACP）基纳米单元。研究首先利用Loewe加性模型来评价药物协同作用确定了1:1（重量比）的RSL3/Ni投料比例。利用核磁共振（NMR）光谱、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）等技术对纳米单元进行了全面的物理化学特性分析，确认了纳米单元的均匀球形形态、尺寸和表面电荷。此外，通过傅里红外光谱（FTIR）和紫外-可见光谱（UV-vis）等技术确认了药物的成功整合。在pH 5.4的条件下，纳米单元表现出快速降解和药物释放的特性，这与CSCs内部溶酶体的酸性环境相匹配，确保了药物的高效释放。在体外模拟体液中，这些纳米单元显示出良好的稳定性，能够保持结构完整性长达48小时。
02纳米单元的免疫调节与药效学评估
①将带有或不带有透明质酸（HA）的CaP-PEG纳米单元用FITC标记，随后与CSCs共培养。结果显示，与未修饰HA的CaP-PEG相比，HuH7来源的CSCs在用CaP-PEG-HA处理后展现出更强的FITC荧光信号。此外，非药物负载的CaP纳米单元与HuH7 CSCs共培养后，细胞活性没有明显降低，证实了载体基质的细胞相容性。WB结果表明，CaP-PEG对STAT3的磷酸化水平没有影响，而CaP-PEG@Ni能有效抑制STAT3的磷酸化，且不影响STAT1的表达，导致PD-L1表达以及干细胞标志物CD44、SOX2和CD133显著降低。还将CaP-PEG-HA@Ni处理的Hepa1-6来源的CSCs与CD8 T细胞共培养，发现与未经处理的CSCs共培养相比，CD8T细胞的数量显著增加。表明CaP-PEG-HA@Ni介导的免疫检查点阻断后CD8T细胞效应功能的恢复。
②研究发现，CaP-PEG-HA@Ni处理显著降低了CSCs中SLC7A11和SLC3A2的表达，并上调了ACSL4。此外，CaP-PEG-HA@Ni处理的CSCs培养基能够诱导ACSL4的上调，与IFNγ的正反馈作用一致。脂质组学分析显示，经CaP-PEG-HA@Ni处理的CSCs在与CD8 T细胞共培养时，其铁死亡相关的多不饱和脂肪酸含量显著增加。CaP-PEG-HA@Ni还能抑制M2型巨噬细胞的极化。实验还发现，在CaP-PEG-HA@Ni/RSL3处理的CSCs中形成了由氧化的PE组成的大量沉淀物。分子模拟分析表明，形成的沉淀物有助于避免氧化PE对CD8 T细胞的抑制作用，从而增强了T细胞的增殖和IFNγ分泌能力。表明，CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元能够提高CSCs对铁死亡的敏感性，并增强T细胞的免疫反应。
03体内疗效与免疫刺激效应评估
①将CSCs与免疫细胞共培养，发现该纳米单元能显著促进CD8 T细胞分泌IFNγ，并在加入铁死亡抑制剂Lip-1后能逆转这一效应。通过TEM观察到CaP-PEG-HA@Ni/RSL3处理的CSCs线粒体损伤最为严重。流式细胞术检测显示，该纳米单元处理显著增加了CSCs的脂质ROS水平，而Lip-1能显著抑制这种效应。此外，CaP-PEG-HA@Ni/RSL3处理还增加了M1/M2巨噬细胞的比例，并促进了M1型巨噬细胞的极化，从而改善了肿瘤微环境中的免疫抑制状况。表明，CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元通过协同铁死亡和免疫疗法，有效抑制了CSCs的生长，并且在健康肝细胞中显示出良好的安全性。
②在小鼠模型中，发现CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元主要聚集在肿瘤组织中，并通过HA配体特异性靶向CSCs。这些纳米单元显著提高了CD8 T细胞分泌IFNγ，增强了免疫反应。同时，它们还促进了肿瘤细胞的铁死亡，减少了肿瘤大小和重量，延长了小鼠的存活时间，并抑制了肿瘤的转移。此外，CaP-PEG-HA@Ni/RSL3治疗降低了CSCs中PD-L1的表达，激活了T细胞，减少了肿瘤干性，并通过改变肿瘤微环境中的M1/M2型巨噬细胞比例，重塑了免疫微环境，减少了免疫抑制。这些效果共同证实了CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元在体内具有低毒性和高效的抗肿瘤活性。
③通过在小鼠模型中测试CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元，发现它们能显著抑制原发肿瘤的生长，并且相比于其他处理组，显示出最低的肿瘤体积和重量。免疫组化分析显示，CaP-PEG-HA@Ni/RSL3处理显著增加了HMGB1的释放，表明其具有强大的免疫原性，有效激活了免疫系统。此外，该治疗还增加了活化的树突细胞和CD8 T细胞的频率，以及记忆T细胞的比例，这些结果表明CaP-PEG-HA@Ni/RSL3能够激发持久的抗肿瘤免疫反应，抑制原发和继发肿瘤的生长，有潜力延长小鼠的生存期。
图1.癌症干细胞对铁死亡诱导的敏感性评估。
图2.基于ACP的纳米单元的合成与表征
图3.CaP-PEG-HA@Ni对CSC靶向免疫调节效果的评估
图4.CaP-PEG-HA@Ni/RSL3促进效应CD8+T细胞分泌IFNγ以促进CSCs中的铁死亡
图5.CaP-PEG-HA@Ni/RSL3对CSCs的体内疗效评估
图6.CaP-PEG-HA@Ni/RSL3体内抗肿瘤效能的评估。
图7.CaP-PEG-HA@Ni/RSL3的免疫刺激效应评估。
图8. abstract
结论与讨论
本研究成功开发了一种基于生物矿化技术的CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元，该单元能有效靶向CSCs，通过同步抑制STAT3和GPX4，诱导CSCs发生铁死亡，并激活免疫反应。研究显示，这种纳米单元在体内外均能显著抑制肿瘤生长和转移，减少肿瘤干性，且具有低毒性。
在未来，将会进一步探索CaP-PEG-HA@Ni/RSL3纳米单元在不同类型肿瘤中的应用潜力，优化药物载量和释放动力学，以实现更高效的治疗效果