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Science 子刊 | Piezo1通道在巨噬细胞激活成纤维细胞中的关键作用
Highlights
1. 促纤维化巨噬细胞与成纤维细胞急性接触可依赖巨噬细胞αvβ3整合素和成纤维细胞Piezo1激活成纤维细胞。
2. Piezo1通道在成纤维细胞中起着核心作用，它能够响应巨噬细胞的接触信号，引发细胞内钙离子水平的变化，促进成纤维细胞的活化。
近日，“Science Advances”（IF=11.7）上发表了一篇题为“Acute contact with profibrotic macrophages mechanically activates fibroblasts via αvβ3 integrin–mediated engagement of Piezo1”的文章。这篇文章研究了在纤维化过程中，促纤维化巨噬细胞如何通过机械方式激活成纤维细胞，以及这一过程中涉及的分子机制。
研究背景介绍
纤维化是一种病理过程，其中正常的组织被异常的纤维组织所替代，导致器官结构和功能的破坏。纤维化可发生在多个器官，如肺、肝和肾，是许多疾病进展的关键因素。
肌成纤维细胞是一种具有收缩能力的细胞类型，它们在组织修复和纤维化过程中起着核心作用。
Piezo1是一种机械敏感离子通道，它在细胞对机械刺激的感知中起重要作用。
研究思路分析
研究技术路线图
01巨噬细胞与成纤维细胞的相互作用及其信号通路
①研究提出，巨噬细胞（Mϕ）通过与成纤维细胞初次接触，通过启动TGF-β1信号或机械刺激（或两者兼有）来激活成纤维细胞。研究中，通过用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（=MM-CSF）处理培养的小鼠骨髓来源的单核细胞，再分别用LPS（=MLPS，促炎）或IL-4加IL-13（=MIL-4/13，促纤维化）处理来极化初级Mϕ。
②追踪转录因子YAP和转录共激活因子TAZ，作为机械肌成纤维细胞激活的指标。实验结果表明，与MIL-4/13接触可以迅速通过YAP/TAZ信号途径激活成纤维细胞，而MLPS则没有这种效果。此外，在软质基质上，MIL-4/13并不通过Smad2/3信号通路激活成纤维细胞，而在硬质基质上则可以观察到Smad2/3的核转位。表明，巨噬细胞的极化状态和基质的机械性质共同影响成纤维细胞的激活和转化。
③研究发现，MIL-4/13接触活的成纤维细胞时，TAZ-citrine核易位且弹性硅胶底物变形增强，推测其可启动ECM与肌成纤维细胞激活的正反馈回路。实验使用了荧光标记弹性收缩表面（FLECSs）来量化收缩程度。结果显示，与MIL-4/13接触可提高成纤维细胞收缩率和速度，而MLPS无显著影响。
④此外，增加MIL-4/13与成纤维细胞的接触数量可以进一步增强收缩反应，而MLPS则没有这种效应。还使用三维胶原蛋白凝胶来观察成纤维细胞的局部收缩反应，发现MIL-4/13接触可以在局部区域显著提高成纤维细胞的收缩能力。表明，促纤维化巨噬细胞通过特定的机械信号传导途径激活成纤维细胞，促进了纤维化过程中的细胞收缩和基质硬化。
02局部力学变化与细胞收缩
①通过将粒子图像测速技术（PIV）转换为牵引力显微图像，发现与MIL-4/13接触后，成纤维细胞的局部收缩应力显著增加。此外，在硬质玻璃基质上培养成纤维细胞，发现MIL-4/13接触增强了成纤维细胞中磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）的染色强度，这是肌球蛋白激活的一个指标。MIL-4/13接触还导致成纤维细胞在接触区域发生局部膜回缩，减少了细胞周长的“实体性”和“圆形度”。还发现在与MIL-4/13接触区域的膜张力和局部硬度较高，这与p-MLC的积累一致。表明，与MIL-4/13的接触而非MLPS的接触，会在接触点引发成纤维细胞的收缩和机械应力。
②p-MLC由肌球蛋白轻链激酶（MLCK）调控，MLCK受胞质Ca2+浓度调控，通过转染GCaMP6s，一种在结合Ca2+时发光的蛋白质，观察到与MIL-4/13接触后5分钟内荧光增加，表明Ca2+浓度升高。此外，核因子活化T细胞1（NFAT1）的水平在接触MIL-4/13的成纤维细胞中比未接触的细胞高1.7倍，进一步证实了Ca2+的激活。表明，与MIL-4/13的接触可以引发成纤维细胞内Ca2+浓度的增加，并导致NFAT1的核转位，而与MLPS的接触则没有这种效果。
03分子机制与药物干预
①测试了两种可能的物理接触依赖性情景：(i)通过异细胞间隙连接直接从Mϕ向成纤维细胞传递钙离子；(ii)巨噬细胞触摸导致成纤维细胞膜上的拉伸激活的离子通道（SACs）开放。结果显示，虽然成纤维细胞和MIL-4/13都表达Cx43蛋白，但它们似乎没有形成功能性间隙连接来介导小分子（如钙离子）的直接交换。进一步的研究表明，SACs对于MIL-4/13诱导的细胞内钙离子升高以及随后的成纤维细胞收缩是必需的。特别是Piezo1通道，在感应MIL-4/13接触方面发挥关键作用，介导细胞内钙离子增加，从而驱动成纤维细胞的收缩。
②通过筛选单细胞RNA测序数据，发现整合素β3亚单位（CD61）在MIL-4/13中独特表达，而在MLPS中几乎不表达。进一步研究发现αv和β3整合素在大多数MIL-4/13表面表达，但在MLPS中仅少量表达。用αvβ3整合素抑制剂cyclo(-RGDfK)和β3整合素阻断抗体Axum4处理MIL-4/13，发现这些抑制剂减少了接触诱导的Ca2+依赖的NFAT1核转位和成纤维细胞收缩。
③在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，证实了β3整合素在促纤维化巨噬细胞中的表达，并在高度纤维化的肺组织中与α-SMA阳性的肌成纤维细胞相邻。表明MIL-4/13上αvβ3整合素的表达对于促进急性接触介导的成纤维细胞激活是必需的。
图1. 急性Mϕ接触在软基质上诱导成纤维细胞应激。
图2. 急性Mϕ接触在硬基质上诱导成纤维细胞核Smad转位
图3. Mϕ接触增强成纤维细胞收缩幅度和速度
图4. 急性促纤维化Mϕ接触诱导局部成纤维细胞收缩
图5. 急性促纤维化Mϕ接触诱导局部成纤维细胞应力
图6. 急性促纤维化Mϕ诱导成纤维细胞内钙离子涌入
图7. Cx43不介导成纤维细胞和MIL-4/13之间的直接通讯
图8. Piezo1介导成纤维细胞在Mϕ接触时的细胞质Ca2+升高
图9. Mϕ整合素αvβ3介导成纤维细胞Ca2+和收缩反应
图10. CD206和αvβ3整合素阳性Mϕ特征性的诱导小鼠肺纤维化
结论与讨论
本研究发现MIL-4/13通过其表面的αvβ3整合素与成纤维细胞接触，迅速激活成纤维细胞内的Piezo1通道，引发细胞内钙离子浓度升高和YAP/TAZ信号通路激活，从而导致成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，促进纤维化过程。
未来的研究需要进一步探索αvβ3整合素与成纤维细胞膜上潜在配体的相互作用，以及这些相互作用如何调节Piezo1通道的开启和细胞内钙离子的变化。此外，还需要验证Piezo1通道激活与YAP/TAZ信号通路之间的直接联系，以及NFAT1在肌成纤维细胞激活中的作用。这些研究将有助于深入理解纤维化的分子机制，并为开发新的治疗策略提供科学依据。