Investigation of BLUF photochemistry by isotopic labeling of flavin cofactor and amino acid side chains

点击翻译按钮获取中文摘要

(BLUF Domänen (Blue light sensors using FAD) enthalten einen bisher wenig verstandenen Flavin Kofaktor, der in ein Wasserstoffbrückennetzwerk eingebettet ist, welches sich in Picosekunden nach Belichtung reversibel umordnet. Der daraus resultierende Signalzustand aktiviert eine assozierte Enzymdomäne oder einen Signaltransduktionspfad. Die molekularen Einzelheiten der primären licht-induzierten Wasserstoffbrückenumordnung sowie die resultierenden Signalprozesse sollen mit Hilfe von Schwingungsspektroskopie aufgeklärt werden. Zeitaufgelöste Schwingungsspektren werden dazu im Bereich von Picosekunden (Pump-Probe) und Minuten (FTIR) aufgenommen. Bisher wurde die Interpretation solcher Spektren aufgrund der Schwierigkeit der Bandenzuordnung behindert. Durch Einführung von ortsgerichteten Isotopenmarkierungen an Aminosäurenseitenketten sowie am Flavinkofaktor werden die zugehörigen Banden verschoben und damit identifiziert. Mit diesem Vorgehen werden wir ein auf molekularer Ebene detailliertes Model der Photoaktivierung in BLUF Domänen erstellen. Selektiv markierte Proteinproben werden in speziellen E. coli Stämmen hergestellt, die zuvor mit entsprechenden Auxotrophien versehen wurden. Zur Markierung des Flavinkofaktors wird ein Riboflavin auxotropher Stamm verwendet, der ein genomisch veranktertes Riboflavinaufnahmesystem besitzt. Durch Zufütterung von Riboflavinisotopomeren werden diese selektiv in die produzierten Protein eingebaut. Die Kombination von Flavin- und Proteinisotopenmarkierung mit state-of-the-art Spektroskopie wird deutlich zum Fortschritt in der BLUF Forschung beitragen und neue Perspektiven für Proteininfrarotspektroskopie aufzeigen.)