Signalmoleküle bei der Regulation des Ionentransports an einem sekretorischen Epithel durch intrazelluläres Ca2+

细胞内 Ca2 调节分泌上皮离子转运的信号分子

• 批准号: 23140063
• 负责人: Professor Dr. Martin Diener
• 金额: --
• 依托单位: Institut für Veterinär-Physiologie und -Biochemie
• 依托单位国家: 德国
• 项目类别: Research Grants
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 德国
• 起止时间: 2005-12-31 至 2009-12-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/23140063?language=en
• 关键词: Signalmolek; le; bei; der; Regulation

Ein Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration löst am Kolonepithel eine massive Ionensekretion aus. Hierbei spielen intrazelluläre Ca2+-Kanäle, die die Freisetzung von Ca2+ aus Speicherorganellen vermitteln, eine wichtige Rolle. Ca2+-abhängige Sekretagoga stimulieren - initial vermittelt über Inositol-1,4,5-Trisphosphat (IP3)-Rezeptoren (IP3R)- eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern, was durch eine Ca2+-induzierte Ca2+- Freisetzung über Ryanodinrezeptoren (Ryr) verstärkt wird. Am Kolonepithel der Ratte besteht ein deutlicher Gradient hinsichtlich der Verteilung von verschiedenen Subtypen von IP3R: der Subtyp IP3R2 ist im Zellkern lokalisiert und wird gleichmäßig von Krypten- wie von Oberflächenzellen exprimiert, während der IP3R3 sich im Zytoplasma lediglich von Oberflächenzellen findet. Die physiologische Bedeutung dieses IP3R3-Gradienten ist völlig unbekannt. Daher sollen an isolierten, mit Fura-2 aufgeladenen Krypten Ca2+-Wellen, die durch Carbachol bzw. direkt durch IP3 ausgelöst werden, im Bereich verschiedener Abschnitte der Krypte untersucht werden. Funktionelle Unterschiede in der sekretorischen Antwort werden durch Aufladen der Krypten mit dem Halid-sensitiven Farbstoff MEQ erfasst, um zu messen, ob die Ca2+-abhängige Cl--Sekretion Unterschiede entlang der Kryptenachse aufweist. Zur definitiven Identifizierung des Zellkerns als Ca2+-Speicher soll die Änderung der nukleären Ca2+-Konzentration nach Aufladung mit Fluo-5N in einem konfokalen Mikroskop untersucht werden. Außerdem soll geklärt werden, ob es neben IP3R2 auch Ryrs im Zellkern gibt. Dazu wird getestet, ob Ryanodin eine Ca2+-Freisetzung aus isolierten Epithelzellkernen auslösen kann. Dies wird durch immunhistochemische Untersuchungen auf licht- und elektronenoptischer Ebene zur Lokalisation von Ryrs ergänzt. Zur Klärung der Frage, wie die Befüllung der nukleären Speicher mit Ca2+ erfolgt, soll zuerst anhand von RT-PCR Experimenten geklärt werden, welche Isoformen von sarko/endoplasmatische Retikulum Ca2+-ATPase (SERCA) bzw. SPCAs (secretory-pathway Ca2+-ATPases) im Kolonepithel exprimiert werden und anschließend die entsprechenden Isoformen immunhistochemisch lokalisiert werden. Außerdem soll die Signalkette, die an der Aktivierung von Ca2+-abhängigen apikalen Cl--Kanälen beteiligt ist, untersucht werden. Vorversuche weisen auf eine zentrale Rolle von NO-Synthasen (NOS) und des Zytoskeletts. In Ussingkammerversuchen wird durch Zugabe von Inhibitoren getestet, welche Form der NO-Synthase an der Signalkaskade beteiligt ist und welche Pharmaka, die Aktin bzw. Tubulin modifizieren, die Signalkette vom Muscarinrezeptor zum apikalen Cl--Kanal unterdrücken. Das erhoffte Ziel dieser Untersuchungen ist es, zum Verständnis der Regulation des intestinalen Elektrolyttransportes und der Induktion von sekretorischen Diarrhoen beizutragen.

一个由大规模离子迁移引起的土壤钙离子浓度降低的实验。在这里，我们将介绍一种用于细胞内Ca 2+测定的试剂盒，这种试剂盒可用于测定细胞内Ca 2+的浓度。Ca 2 +-抑制剂Sekretagoga stimulieren -初始刺激剂Inositol-1，4，5-Trisphosphat（IP 3）-Rezeptoren（IP 3R）- eine Freisetzung von Ca 2 + aus intrazellulären Speichern，是通过Ca 2 +-诱导Ca 2 +- Freisetzung über Ryanodinrezeptoren（Ryr）verstärkt wird.在大鼠的大肠杆菌中，最好的是一种德国的梯度hinsichtlich对IP 3R亚型的检测：IP 3R 2亚型是Zellkern lokalisiert，并且会像Oberflächenzellen一样对Krypten产生轻微的影响，而IP 3R 3则是在Oberflächenzellen发现的Zytoplasma lediglich。IP 3R 3的生理学基础是不确定的。用Fura-2使Ca ~（2+）离子溶于氨甲酰甲烷中，可获得一种隔离物。直接通过IP 3的韦尔登，在Bereich verschedener Abschnitte der Krypte untersucht韦尔登。用卤素敏感的Farbstoff MEQ法测定氪气对韦尔登的渗透率，通过对氪气中Ca ~（2+）-Cl ~（2+）的渗透率的测定。在一个韦尔登中，用Fluo-5 N进行培养后，细胞内Ca 2+浓度的确定性鉴定需要细胞内Ca 2+浓度的测定。因此，它可以韦尔登，也可以在Zellkern中使用IP 3 R2。因此，Ryanodin可以通过单独的上皮细胞获得Ca 2 +-Freisetzung。通过免疫组织化学方法检测光和电子光学标记，可确定Ryrs的局部化。因此，采用RT-PCR技术，通过对细胞内Ca ~（2+）-ATP酶同工酶（Serca）的检测，可以获得韦尔登内Ca ~（2+）-ATP酶同工酶（Serca）。用免疫组化方法检测分泌途径Ca ~（2+）-ATP酶在大肠上皮中的表达。因此，信号传导，以及激活Ca 2 +-ABHängigen apikalen Cl--的途径，都是韦尔登。本研究以一氧化氮合酶（NOS）和酵母菌为中心。在使用中，通过Zugabe对抑制剂进行测试，发现NO合成酶和信号转导通路的形式以及药物，Aktin bzw。微管蛋白的修饰，使得来自于Muscarinrezeptor的信号传导途径在Cl-卡纳尔通道中得以表达。Das erhoffte Ziel dieser Untersuchungen is es，zum Verständnis der Regulation des Escherinalen Elektrolyttransportes und der Induktion von seklischen Diarrhoen beizutragen.