転写プラットフォーム因子Zfhxファミリーによる骨格形成の時空間的制御機構の解明

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１．Zfhx3およびZfhx4の標的遺伝子を解析するために、Flagタグを付与したZfhx4ノックインマウスから細胞を採取し、抗Flag抗体を用いたクロマチン免疫沈降法の条件検討を行い、その最適化を行った。またクロマチン構造の解析を行うために、従来より行われているATAC-seq解析より鋭敏であるとされている、Cut&Run法での解析手法の解析化を行った。これらの研究結果より、Flag-Zfhx4ノックインマウスの骨芽細胞、軟骨細胞および肢芽細胞を用いて、分子生物学的解析を行う基盤が構築できた。２．Zfhx3シングルノックアウトマウスを用いて、Zfhx3の骨格形成における解析を行った。その結果、Zfhx3ノックアウトでは、明確な骨格形成異常を認めなかった。この解析結果より、骨格形成におけるZfhx3の機能は、Zfhx4により代償されいると推測された。そこで、Zfhx3およびZfhx4ダブルノックアウトマウスを作製したが、早期致死を来たしているようため、その解析は困難であった。この点を解消するために、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いて、Zfhx3 floxマウスの作製に取り掛かった。令和４年度までに、Zfhx3の遺伝子座に一箇所のloxP配列を挿入したマウスの作製を行った。ゲノムDNAを用いたPCRおよびDNAシークエンス解析により、loxP配列の挿入を確認できた。引き続き、Zfhx3遺伝子座のもう一箇所にloxP配列を挿入して、Zfhx3コンディショナルノックアウトマウスの作製を進め、最終的にはZfhx3およびZfhx4コンディショナルノックアウトマウスの作製ならびに解析を行う体制が整った。