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Elucidation of the mechanism by which tRNA thiolation enzymes with iron-sulfur clusters regulate two different reactions

阐明具有铁硫簇的 tRNA 硫醇化酶调节两种不同反应的机制

基本信息

批准号：
21J12999
负责人：
石坂優人
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は昨年度、2-チオウリジン合成酵素TtuAに結合した鉄硫黄クラスター構造とTtuAの酵素活性を経時的に相関解析し、活性型TtuAは[4Fe-4S]鉄硫黄クラスターのみ持つことを明らかにした。今年度は、これらの結果を査読あり国際誌International Journal of Molecular Sciences誌に発表するとともに、TtuAのtRNA活性化機構（アデニル化tRNA合成機構）の解明を目指した。TtuA-tRNA複合体の精製は困難だったため、TtuAの結晶に基質塩基5-メチルウリジン（m5s2U）またはUMP、さらにATPをソーキングし、X線結晶構造解析に取り組んだ。その結果、分解能2.5 Å程度で[4Fe-4S]-TtuAとATPまたはADPとの複合体の電子密度を得た。これらの構造は、TtuAがATPをADPに加水分解し、tRNA活性化に利用する可能性を示唆している。一方で、ATPを利用した時のTtuAの酵素活性（m5s2U合成活性）に比べ、ADPを利用した時の酵素活性は約3割しかなかった。したがって、tRNA活性化にATPが直接使われるか、ADPが使われるかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。次に我々は、TtuAと基質塩基との相互作用様式を明らかにするために、tRNAリシジン合成酵素TilS-tRNA複合体の構造に基づき、TtuA-m5s2U-ATP複合体のモデル構造を構築した。さらに、このモデル構造に基づいて8種類の変異体を作成し、HPLCでTtuAの酵素活性を解析した。その結果、R138A変異体の酵素活性が完全に消失した。我々のモデル構造では、Arg138はm5s2Uのリン酸基と相互作用しており、TtuAファミリー内で完全に保存されている。したがって我々は、Arg138がTtuA-tRNA複合体形成に必須であると結論付けた。

We analyzed the correlation between the structure of TtuA and the activity of TtuA, and found that the activity of TtuA was related to [4Fe-4S] iron sulfur. This year, the International Journal of Molecular Sciences published a report on tRNA activation mechanism (tRNA synthesis mechanism). The purification of TtuA-tRNA complex is difficult. The crystallization of TtuA is based on the 5-mer matrix (m5s2U), UMP and ATP. X-ray crystal structure analysis is used to select the composition. As a result, the electron density of [4Fe-4S]-TtuA and ATP and ADP complexes was obtained. The structure of this protein is shown by the possibility of hydrolysis of ATP and ADP and activation of tRNA The enzyme activity of TtuA (m5s2U synthesis activity) was about 3 times higher than that of ATP and ADP. It is necessary to study the activity of ATP and ADP directly. The structure of TtuA-m5-s2U-ATP complex was constructed. The enzyme activity of TtuA was analyzed by HPLC. As a result, R138A enzyme activity was completely lost. Arg138 and Arg 5S 2U are completely preserved in the molecular structure. Arg138 is essential for the formation of TtuA-tRNA complexes.