Study on the mechanism of histone H2A.Z remodeling and development of a novel reprogramming technology

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本研究は、体細胞核移植（SCNT）胚の発生能を改善するHDAC阻害剤がSCNT後のドナー細胞核からのヒストンH2A.Zの除去作用をもつことに着目し、その分子メカニズムを解明することを目的とする。［課題Ⅰ］受精卵におけるヒストンH2A.Zの除去過程で相互作用する因子の探索と機能解析活性化卵子(6hpa)に電気穿孔法でGFP-H2A.Z及びH2A.XのC末端23個のアミノ酸を付加したGFP-H2A.Z_XC23 mRNAを導入し局在について解析した。その結果、GFP-H2A.Zは24hpaから急速に消失する一方、GFP-H2A.Z_XC23は48hpaまで核内に維持された。さらに、GFP-H2A.Z_XC23の発現により発生遅延や発生停止が観察された。次に、同様の方法で、ヒストンH2A.Zの除去機構への新規転写の関与について検討を行った。その結果、αアマニチン6~24hpa添加区では徐々に減少は認めたものの96hpaにおいても核局在は維持された。これらの結果より、ヒストンH2A.Zの除去には卵子の活性化に伴う新規転写が関与している可能性が示された。［課題Ⅱ］ 受精卵におけるHDAC阻害剤と相互作用する因子の探索と機能解析SCNTで有効なHDACiであるSAHA固定化した磁気ビーズを用いて、線維芽細胞、MⅡ期卵子、活性化卵子(6hpa)でChemical pull-downと質量解析を行った。その結果、線維芽細胞からは864因子、MII期卵子からは139因子、6hpaからは101因子が検出された。MII期卵子と活性化卵子で共通して検出される卵子特異的なSAHAのターゲットを16因子に絞り込んだ。そのうちIsoform 2 of Probable E3 ubiquitin-protein ligase (DTX2)のみMII期卵子と活性化卵子で高頻度に検出されていた。DTX2はZn fingerのひとつであるRING finger domainを有しており、in vitro translationとchemical pull-downによりSAHAと直接相互作用することを確認した。以上から、DTX2の阻害作用がSCNT後の発生能改善に繋がっている可能性が示された。