权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

Mechanism of the apoptotic program of eggs blocked by fertilization

受精阻断卵细胞凋亡程序的机制

基本信息

批准号：
21K06185
负责人：
千葉和義
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Ochanomizu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06185/
关键词：
ヒトデ卵母細胞アポトーシス受精 caspase-3/9 Apaf-1 電子顕微鏡自己切断卵

项目摘要

本年度の研究によって、大腸菌リコンビナントCARDを用いて、クライオ顕微鏡観察によってCARDフィラメント構造が明らかになった。哺乳類における他のcaspaseにおけるCARDフィラメントと同様に、I,II,IIIの結合面を持っていることも明らかになった。このフィラメントが真にアポトーシスにおいて形成されていることを確かめるために、CARDを含む全長caspase-3/9のリコンビナントタンパク質を合成して、フィラメント形成が起こるかどうかを調べている。その研究過程で、活性型caspase-3/9では自己切断によって、タンパク質を安定的に維持できない問題が生じた。そこで、活性中心のアミノ酸を突然変異させたcaspase-3/9を作成した。大腸菌の中で発現すると、フォールディングがしっかりと起きないことが危惧されたので、小麦胚芽発現系を用いて合成している。現在、ネガティブ染色法で電子顕微鏡観察を行い、フィラメント形成が起こっているかどうかを調べている。さらに、切断前の不活性型caspase-3/9が重合caspase-3/9 CARDと結合し、活性型となることを証明するために、自己切断部位の突然変異型caspase-3/9を作成した。それが、重合caspase-3/9 CARDと相互作用するか、そして活性化するかどうかを、低分子性の蛍光基質を用いて確認したところ、CARDによって活性が上昇することを検出できた。したがって、切断前の不活性型caspase-3/9がCARDフィラメントによって活性型に変化することが、確かめられた。

This year's research focuses on the use of E. coli, microscopical observation of CARD and its structure. Mammalian Caspase 3-Caspase 4-Caspase 5-Caspase 6-Caspase 7-Caspase 8-Caspase 9-Caspase 9-Caspase 9 Caspase-3/9 is a full-length caspase, which is contained in the CARD. During the research process, the active caspase-3/9 is not stable, and the quality of the protein is stable. Caspase-3/9 is the most important component of the protein. Coliform bacteria are produced in the medium, and wheat germ is produced in the medium. Now, the electron microscope is used to detect the color of the dye, and the color of the dye is used to form the dye. The inactive caspase-3/9 before cleavage was combined with the active caspase-3/9 CARD, and the mutant caspase-3/9 at the site of cleavage was produced. Caspase-3/9 CARD interaction, activation, and low molecular weight fluorescent substrates were identified. The inactive caspase-3/9 was isolated from the active caspase-3/9.