Mechanism of the apoptotic program of eggs blocked by fertilization

本年度の研究によって、大腸菌リコンビナントCARDを用いて、クライオ顕微鏡観察によってCARDフィラメント構造が明らかになった。哺乳類における他のcaspaseにおけるCARDフィラメントと同様に、I,II,IIIの結合面を持っていることも明らかになった。このフィラメントが真にアポトーシスにおいて形成されていることを確かめるために、CARDを含む全長caspase-3/9のリコンビナントタンパク質を合成して、フィラメント形成が起こるかどうかを調べている。その研究過程で、活性型caspase-3/9では自己切断によって、タンパク質を安定的に維持できない問題が生じた。そこで、活性中心のアミノ酸を突然変異させたcaspase-3/9を作成した。大腸菌の中で発現すると、フォールディングがしっかりと起きないことが危惧されたので、小麦胚芽発現系を用いて合成している。現在、ネガティブ染色法で電子顕微鏡観察を行い、フィラメント形成が起こっているかどうかを調べている。さらに、切断前の不活性型caspase-3/9が重合caspase-3/9 CARDと結合し、活性型となることを証明するために、自己切断部位の突然変異型caspase-3/9を作成した。それが、重合caspase-3/9 CARDと相互作用するか、そして活性化するかどうかを、低分子性の蛍光基質を用いて確認したところ、CARDによって活性が上昇することを検出できた。したがって、切断前の不活性型caspase-3/9がCARDフィラメントによって活性型に変化することが、確かめられた。

本年度の研究によって、大腸菌リコンビナントCARDを用いて、クライオ顕微鏡観察によってCARDフィラメント構造が明らかになった。哺乳類における他のcaspaseにおけるCARDフィラメントと同様に、I,II,IIIの結合面を持っていることも明らかになった。このフィラメントが真にアポトーシスにおいて形成されていることを確かめるために、CARDを含む全長caspase-3/9のリコンビナントタンパク質を合成して、フィラメント形成が起こるかどうかを調べている。その研究過程で、活性型caspase-3/9では自己切断によって、タンパク質を安定的に維持できない問題が生じた。そこで、活性中心のアミノ酸を突然変異させたcaspase-3/9を作成した。大腸菌の中で発現すると、フォールディングがしっかりと起きないことが危惧されたので、小麦胚芽発現系を用いて合成している。現在、ネガティブ染色法で電子顕微鏡観察を行い、フィラメント形成が起こっているかどうかを調べている。さらに、切断前の不活性型caspase-3/9が重合caspase-3/9 CARDと結合し、活性型となることを証明するために、自己切断部位の突然変異型caspase-3/9を作成した。それが、重合caspase-3/9 CARDと相互作用するか、そして活性化するかどうかを、低分子性の蛍光基質を用いて確認したところ、CARDによって活性が上昇することを検出できた。したがって、切断前の不活性型caspase-3/9がCARDフィラメントによって活性型に変化することが、確かめられた。