細胞内プロテアーゼ活性のin vivo, real time測定法

体内、实时测量细胞内蛋白酶活性的方法

• 批准号: 11144214
• 负责人: 千葉 和義
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Ochanomizu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11144214/
• 关键词: プロテアリーム; マイクロインジェクション; pH; ウニ; プロテアーゼ

生きた1細胞の、内在性プロテアーゼ活性定量法の確立が、本研究の目的である。我々は、細胞膜不透過性の蛍光物質として、7-aminocoumarin-4-methanesulfonic acid (ACMS) を開発した。ACMSにペプチドを結合させると、各種の細胞内プロテアーゼ基質が合成できる。ウニ卵(タコノマクラ卵)にSuc-Phe-Leu-Arg-ACMSをマイクロインジェクションし、受精時におけるプロテアソーム活性を求めた。驚くべきことに、受精後3分で基質分解初速度(Vo)は、受精前の約10倍にも上昇していた。一方、pH感受性蛍光色素BCECFを用い測定したところ、受精によって、細胞内のpHは7.2から7.5に上昇することが明らかになった。そこでpH7.5のバッファをマイクロインジェクションして細胞内pHの上昇を引き起こしたところ、受精なしでプロテアソームの活性は上昇した。このときEGTAを同時にマイクロインジェクションして、細胞内のカルシウム上昇を抑えても、プロテアソームの活性化は起こった。したがって、受精時に引き起こされる細胞内pHの上昇によって、プロテアソームが活性化されるが、この活性化は細胞内遊離カルシウム濃度の上昇には依存しないことが明らかになった。大変興味深いことに、ヒトデ卵を用いて作成したcell free系においても、使用するバッファのpHを上昇させると、サイクリン分解が促進されることが明らかになった。このことは、一般にプロテアソーム活性が細胞内pHに依存して制御されている可能性を示唆する。

The purpose of this study is to establish a quantitative method for the determination of endogenous and endogenous activity in human cells. The development of 7-aminocoumarin-4-methanesulfonic acid (ACMS), a light-impermeable substance in cell membranes, was reported. When ACMS is selected and combined, a variety of intracellular protoplasts can be synthesized. Suc-Phe-Leu-Arg-ACMS is the most active method for sperm production. The initial rate of stroma decomposition (Vo) was about 10 times higher than that before fertilization. A pH-sensitive pigment BCECF is used to determine the pH of the cell, and the pH of the cell rises from 7.2 to 7.5. In addition, the activity of the enzyme was increased due to the increase of intracellular pH and fertilization. The EGTA is activated by the activation of the cell. The increase of intracellular pH during fertilization is dependent on the increase of intracellular free pH concentration. A cell free system is created for the use of high temperature and high humidity, and the pH of the solution is increased. This indicates the possibility that the activity of the enzyme is dependent on intracellular pH and that it can be controlled.

项目成果

Nakano, Tsuyoshi: "G-protein βγsubunit-dependent phosphorylation of 62-kDa protein in early signaling pathway of starfish oocyte maturation induced by 1-methyladenine"Developmental Biology. 209. 200-209 (1999)

Nakano，Tsuyoshi：“1-甲基腺嘌呤诱导的海星卵母细胞成熟的早期信号通路中 62-kDa 蛋白的 G 蛋白 βγ 亚基依赖性磷酸化”发育生物学 209. 200-209 (1999)。

Chiba, Kazuyoshi: "Induction of germinal vesicle breakdown in a cell-free preparation from starfish oocytes"Developmental Biology. 205. 217-223 (1999)

Chiba，Kazuyoshi：“海星卵母细胞无细胞制剂中生发囊泡分解的诱导”发育生物学。

Chiba, Kazuyoshi: "Activation of the proteasomes of sand dollar eggs at fertilization depends on the intracellular pH rise"Developmental Biology. 209. 52-59 (1999)

Chiba, Kazuyoshi：“受精时沙钱卵蛋白酶体的激活取决于细胞内 pH 值的上升”发育生物学。