細胞内プロテアーゼ活性のin vivo,real time測定法

体内、实时测量细胞内蛋白酶活性的方法

基本信息

批准号：
09267211
负责人：
千葉和義
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Ochanomizu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞を生かしたまま、内在性プロテアーゼ活性を定量する。もしもこれが可能になれば、real timeで酵素活性変化が追跡できるし、細胞を破壊するために生じるア-ティファクトの心配もない。この要求が本研究の出発点となった。しかしながら、市販のプロテアーゼ基質は、細胞膜に対して透過性が高く、本研究の目的には添わなかった。そこで我々は、蛍光物質、7-aminocoumarin-4-methanesulfonic acid(ACMS)を開発した。ACMSは細胞膜不透過性であり、7位のアミノ基にペプチドを結合することによって、プロテアーゼ基質が合成できる。Suc-Phe-Leu-Arg-ACMSを合成して、ヒトデ卵母細胞にマイクロインジェクションしたところ、卵の蛍光量が増加した。この蛍光量の増加は、プロテアーゼ阻害剤(特にプロテアソーム阻害剤)によって特異的に阻害されたことから、卵内のプロテアソーム活性に対応すると考えられた。そこで光電子倍増管を蛍光顕微鏡に接続し、生きた卵母細胞1個における蛍光強度の増加率、すなわち基質分解の初速度を定量した。すると大変興味深いことに、ホルモンによる減数分裂再開と同時に、蛍光基質の分解初速度が上昇し始めた。さらにこの上昇は、第一減数分裂の後期または終期まで続くことが明らかになった。したがってこの結果から、卵成熟過程において、プロテアソームの酵素的な性質が変化していることが予測される。そこでさらに速度論的な解析を行うために、生きた細胞内に於けるVmaxおよびKmの測定を試みた。ホルモンで処理する前の未成熟卵と処理後約80分の成熟卵に、各種濃度の基質をマイクロインジェクションし、それぞれの初速度を求めプロットしたところ、成熟卵と未成熟卵のVmaxは、2.3と0.84(μM/min)であることが算出された。一方Kmについては、60と30(μM)のであることが明らかになった。これらの結果は、確かにヒトデ卵成熟過程において、プロテアソームの酸素的性質が変化していることを示している。ホルモン処理後約80分には、M期促進因子(MPF)の構成要素であるサイクリンBが、プロテアソームによって分解される。この酵素活性の変化は、M期終了時のサイクリンB分解に関与する可能性も考えられる。また、受精時においても、プロテアソーム活性が一時的に上昇することを見いだした。

内源性蛋白酶活性在保留细胞时进行定量。如果可能的话，实时可以跟踪酶活性的变化，并且无需担心细胞损害中发生的atifacts。这项要求是这项研究的起点。但是，市售的蛋白酶底物对细胞膜高度渗透，并且不适合本研究的目的。因此，我们开发了荧光材料，即7-氨基氨基蛋白-4-甲磺酸（ACM）。 ACM对细胞膜不渗透，并且可以通过将肽与位置7的肽组结合与氨基组结合来合成蛋白酶底物。合成了Suc-Phe-Phe-Leu-Leu-arg-Acms并将微型注射到Starfish卵母细胞中，以及卵的荧光量增加。荧光抑制剂（尤其是蛋白酶体抑制剂）特别抑制了荧光的这种增加，并被认为对应于卵中的蛋白酶体活性。因此，将光电倍增管连接到荧光显微镜，以量化一个活卵母细胞中荧光强度的增加，即底物降解的初始速率。非常有趣的是，荧光底物的初始降解速率与激素恢复引起的减数分裂同时开始增加。此外，这一增加据透露持续到第一个减数分裂的后期或结束。因此，该结果预测蛋白酶体在鸡蛋成熟过程中变化的酶特性。因此，为了进一步进行动力学分析，我们试图测量活细胞中的VMAX和KM。在处理后用激素和成熟的卵处理之前，将各种浓度的底物显微注射到未成熟的卵中，并绘制每个卵的初始速度。成熟的卵和未成熟卵的Vmax计算为2.3和0.84（μm/min）。另一方面，据揭示了KM是60和30（μm）。这些结果无疑表明，在海星卵成熟过程中，蛋白酶体的氧特性变化。激素处理后约80分钟，蛋白酶体会降解M相启动子（MPF）的Cyclin B（MPF）。在M期结束时，酶活性的这种变化也可能与细胞周期蛋白B降解有关。还发现，即使在受精过程中，蛋白酶体的活性也会暂时增加。