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細胞内プロテアーゼ活性のin vivo,real time測定法

体内、实时测量细胞内蛋白酶活性的方法

基本信息

批准号：
09267211
负责人：
千葉和義
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Ochanomizu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞を生かしたまま、内在性プロテアーゼ活性を定量する。もしもこれが可能になれば、real timeで酵素活性変化が追跡できるし、細胞を破壊するために生じるア-ティファクトの心配もない。この要求が本研究の出発点となった。しかしながら、市販のプロテアーゼ基質は、細胞膜に対して透過性が高く、本研究の目的には添わなかった。そこで我々は、蛍光物質、7-aminocoumarin-4-methanesulfonic acid(ACMS)を開発した。ACMSは細胞膜不透過性であり、7位のアミノ基にペプチドを結合することによって、プロテアーゼ基質が合成できる。Suc-Phe-Leu-Arg-ACMSを合成して、ヒトデ卵母細胞にマイクロインジェクションしたところ、卵の蛍光量が増加した。この蛍光量の増加は、プロテアーゼ阻害剤(特にプロテアソーム阻害剤)によって特異的に阻害されたことから、卵内のプロテアソーム活性に対応すると考えられた。そこで光電子倍増管を蛍光顕微鏡に接続し、生きた卵母細胞1個における蛍光強度の増加率、すなわち基質分解の初速度を定量した。すると大変興味深いことに、ホルモンによる減数分裂再開と同時に、蛍光基質の分解初速度が上昇し始めた。さらにこの上昇は、第一減数分裂の後期または終期まで続くことが明らかになった。したがってこの結果から、卵成熟過程において、プロテアソームの酵素的な性質が変化していることが予測される。そこでさらに速度論的な解析を行うために、生きた細胞内に於けるVmaxおよびKmの測定を試みた。ホルモンで処理する前の未成熟卵と処理後約80分の成熟卵に、各種濃度の基質をマイクロインジェクションし、それぞれの初速度を求めプロットしたところ、成熟卵と未成熟卵のVmaxは、2.3と0.84(μM/min)であることが算出された。一方Kmについては、60と30(μM)のであることが明らかになった。これらの結果は、確かにヒトデ卵成熟過程において、プロテアソームの酸素的性質が変化していることを示している。ホルモン処理後約80分には、M期促進因子(MPF)の構成要素であるサイクリンBが、プロテアソームによって分解される。この酵素活性の変化は、M期終了時のサイクリンB分解に関与する可能性も考えられる。また、受精時においても、プロテアソーム活性が一時的に上昇することを見いだした。

Cell viability is quantified. The enzyme activity may be changed at real time, and the enzyme activity may be changed at real time, and the enzyme activity may be changed at real time. The requirements of this study are discussed in detail. The aim of this study is to increase the permeability of cell membranes and substrates. 7-aminocoumarin-4-methanesulfonic acid(ACMS) was developed. ACMS is composed of cell membrane impermeability and 7-position matrix. Suc-Phe-Leu-Arg-ACMS was synthesized and the amount of protein in oocytes increased. The increase in the amount of light, the amount of light, the increase in the amount of light, the amount of light, the increase in the amount of light, the amount of light, the increase in the amount of light, the increase in the amount of light, the amount of light, the amount of light The increase rate of light intensity and the initial rate of matrix decomposition in oocytes were quantified by using photoelectron microscopy. At the same time, the initial rate of meiosis re-opening and decomposition of light matrix increased. The first meiotic anaphase and the second meiotic anaphase are the first meiotic anaphase and the last meiotic anaphase. The properties of the enzymes in the egg maturation process are predicted. The analysis of the velocity theory is carried out in the cell and the measurement of the Vmax and Km is carried out. Immature eggs before treatment and mature eggs about 80 minutes after treatment, various concentrations of matrix, medium, medium, One side Km The result is that the properties of the amino acids in the egg maturation process change. About 80 minutes after treatment, the components of MPF were decomposed. The enzyme activity changes, and the possibility of decomposition at the end of the M phase is examined. When fertilization occurs, the activity increases.