蛍光偏光度測定による細胞内蛋白質リン酸化反応の可視化

通过荧光偏振测量可视化细胞内蛋白质磷酸化反应

基本信息

  • 批准号:
    09780650
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.79万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1997
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1997 至 1998
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

細胞生物学が対象としている多くの生命現象に、蛋白質リン酸化反応は関わっている。その反応の検出には、ラジオアイソトープやリン酸基に対する抗体などが用いられてきたが、基本的に破壊検査を伴っている。生きた細胞のまま、すなわちin vivo,in situ,さらにreal temeでリン酸化反応を検出できる技術は知られていない。本研究では、そのような技法の確立を目指し、リン酸基と結合する蛍光物質を作成し、蛍光偏光度を測定することによって、リン酸化された蛋白質の量を定量する。そのために、蛋白質のリン酸基と結合するペプチド断片を、ファージまたは大腸菌表面蛋白質に発現させたペプチドライブラリーを用い作成し、蛍光物質(FITCなど)でラベルする。次に、蛍光偏光度を測定することによって、蛍光ペプチド断片とリン酸基との結合をモニターし、リン酸化された蛋白質の量を定量する。9〜10年度にかけて、この目的達成のために、大腸菌表面にランダムペプチドを発現するライブラリー(FliTrx random peptide display library)を用いた。リン酸化チロシンと結合するペプチドを発現しているものを、クローニングするために、リン酸化チロシンをビオチン化した。次に、ビオチン化リン酸化チロシンをアビジンコートされたプレートに結合させ、これに結合する大腸菌を回収した。大腸菌をアガープレートにまいて、得られたクローンをそれぞれ再度培養した。次にそれぞれのクローンが真にリン酸化チロシンに結合するペプチドを発現しているか否かを明らかにするために、FITCラベルしたリン酸化チロシンを作成し、蛍光偏光度の変化を指標にしてスクリーニングしたが、ポジティブなクローンは得られなかった。残念ながら、十分に強く結合するペプチド配列が存在しない可能性が考えられた。現在、ファージ表面にランダムペプチドを発現するライブラリーを使用して、同様な実験を行っているが、良い結果は今のところ得られていない。パニングの条件を色々検討することで、何とか成功させたいと努力している。
Cell biology is related to many biological phenomena, protein production and acidification. The anti-virus detection system, the anti-virus detection system and the anti-virus detection system. In vivo, in situ, in real time, in vitro, in vivo,in situ, in situ, in vivo, in vivo, in situ, in vivo, in vivo, in situ, in situ, This study aims to establish a method for determining the amount of light and protein. In addition, the protein protein binding protein fragments, protein fragments, protein molecules, protein molecules, Second, the determination of the degree of polarization of the light, the determination of the amount of light, the amount of light, the amount 9 ~ 10 years to achieve this goal, coliform surface selection and development of the first batch of bacteria (FliTrx random peptide display library) was used. The acid solution and the combination of the two solutions are discussed in detail. In addition, the production of E. coli from the production of E. coli from the production of E. coli Coliform bacteria were cultured in vitro. The second is to create an index of polarization of light, such as the index of polarization of light, the index of polarization of light, and the index of polarization of light. There is a possibility that the combination of residual and very strong elements may exist. Now, the surface of the film is the same as the surface of the film. The conditions of the project are discussed in detail.

项目成果

期刊论文数量(1)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Chiba,K.: "Induction of germinal vesicle breakdown in a cell-free preparation from starfish oocytes." Dev.Biol.205. 217-223 (1999)
Chiba,K.:“在海星卵母细胞的无细胞制剂中诱导生发囊泡分解。”
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Nakano,T.: "G-protein βγsubunit-dependent phosphorylation of 62-kDa protein in early signaling pathway of starfish oocyte maturation induced by 1-methyladenine." Dev.Biol.(in press). (1999)
Nakano, T.:“1-甲基腺嘌呤诱导的海星卵母细胞成熟的早期信号通路中 62-kDa 蛋白的 G 蛋白 βγ 亚基依赖性磷酸化。”(正在出版)。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
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    佐藤 啓介;杉﨑 綾奈;千葉 和義;齊藤 健太;川岸 将彦;Shalin B. Mehta;白水 美香子;谷 知己;寺田 純雄
  • 通讯作者:
    寺田 純雄
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  • 发表时间:
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  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
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  • 通讯作者:
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  • 作者:
    田村 りつ子;高田 真理子 ;吉田 綾香;千葉 和義
  • 通讯作者:
    千葉 和義

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知道了