ゼブラフィッシュにおける筋発生異常モデルと新規薬剤プラットフォームの作成

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横隔膜に欠損孔を形成する疾患である横隔膜ヘルニアの欠損孔発生の機序や筋の発生機所を探るべく、筋肉の先天的欠損もしくは発生異常を伴うゼブラフィッ シュモデルを作成し、評価することで、筋肉の発生機序に関する分子メカニズムをin vivoで解明し、最適な疾患モデルを開発し、最終的には新たな薬剤プラットフォームを作成する事を目標としている。平滑筋形成不全モデル作成では、腸管機能不全の一つであるMMIHSの原因遺伝子として、主にLMOD1をターゲットとした。ゼブラフィッシュの受精卵にmicroinjectionを行うことでCRISPR/Cas9法でLMOD1遺伝子の欠失を引き起こし、この受精卵を育成した稚魚の腸管蠕動の評価を行った。蛍光飼料を摂取させてその排泄割合を評価するGut Transit Assay、および、腸管蠕動を動画に収めて蠕動速度や頻度を評価するSpatiotemporal Mappingの2つの評価方法において遺伝子欠失を起こした個体において排泄率の低下、および、腸管蠕動速度の低下を認めた。また、骨格筋発生機序の解明の一環として、筋前駆細胞の制御により筋形成に関わっているPax7の挙動の追跡を試みた。具体的にはPax7と共発現できるようにGFP遺伝子を挿入するモデルをmicroinjectionにより作成し、成長に伴ったPax7発現細胞の挙動の追跡を試みている。現在、挿入におけるCRISPR/Cas9のtarget sightの絞り込みを行い、有力な2箇所を同定した。今後、GFP遺伝子配列を持つDNA二重鎖とともにmicroinjectionを行い、モデルを作成、評価していく予定である。