PINK1-Parkin経路の網羅的プロテオーム解析とミトコンドリア制御の解明

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家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物であるセリン/スレオニンキナーゼPINK1とユビキチン連結酵素Parkinが協調して損傷ミトコンドリアをオートファジーによって特異的に除去する分子機構の概要が最近明らかになった。しかしながら、従来の細胞生物学や分子生物学を基盤とする研究からは、その全体像を理解する上で十分な知見が得られていない。特に損傷ミトコンドリアの外膜上で安定化し蓄積したPINK1が形成する複合体の構成因子を大規模に明らかにするためには、高度なプロテオーム解析技術が必須である。これまでに免疫沈降-質量分析（IP-MS）法を改良・最適化することにより、既知のPINK1結合因子であるTOM複合体構成因子だけでなく、TIM複合体構成因子であるTIM23を新たなPINK1結合因子として見出した。TIM23はPINK1と相互作用することによってミトコンドリア内膜のプロテアーゼによるPINK1の分解を防ぐ役割を担っていることが示唆された。そこで本年度は、PINK1の免疫沈降物中に含まれるTIM23を絶対定量することを試みた。PINK1およびTIM23由来のトリプシン消化ペプチドに相当する、安定同位体で標識したAQUAペプチドを３本ずつ合成した。脱共役剤で処理した細胞から調製したPINK1の免疫沈降物にこれらのAQUAペプチドを200 fmolずつスパイクしてトリプシン消化後、PRM法を用いたターゲット質量分析による定量解析を行った。その結果、PINK1の約1/5量のTIM23が共免疫沈降していることが明らかになった。