リン酸化プロテオーム解析によるERK及びROCKの基質の網羅的同定と機能解析

通过磷酸化蛋白质组分析对 ERK 和 ROCK 底物进行全面鉴定和功能分析

• 批准号: 16770141
• 负责人: 小迫 英尊
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16770141/
• 关键词: MAPキナーゼ; プロテオミクス; リン酸化; 核膜孔; ヌクレオポリン; 核内輸送; ダイニン; 2D-DIGE; IMAC; 網羅的解析; ERK; 質量分析計; 二次元電気泳動

本研究では、様々な細胞内シグナル伝達で鍵となるプロテインキナーゼであるERKとROCKをモデル系とし、その細胞内基質群を網羅的に同定するための新たなリン酸化プロテオーム解析法を開発して、得られた新規基質のリン酸化による機能制御を解明することを目標としている。これまでに、IMACによる全タンパク質からのリン酸化タンパク質の精製法と蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)技術を併用することにより、ERK/MAPキナーゼ経路に位置するリン酸化タンパク質を33種類同定することに成功した。本年度は特に、この中に含まれていた核膜孔複合体の構成因子(ヌクレオポリン)の一つであるNup50と細胞質ダイニンの中間鎖CDIC2に注目し、これらが新規ERK基質かどうか検討した後、その生理的意義を明らかにすることを目的とした。GST融合タンパク質として精製したNup50もCDIC2も活性型ERK2によりin vitroで強くリン酸化されたため、ESI-IT型質量分析計を用いた解析とアラニン残基への点変異の導入によって各々のリン酸化部位を同定した。そして各々の部位に対する抗リン酸化抗体を作製することにより、Nup50とCDIC2が細胞内でERK活性化に依存してリン酸化されることを示した。Nup50はN末端ドメイン(importin-αと結合)、中央のFGリピートドメイン(importin-βと結合)、C末端のRan結合ドメインから構成されるが、ERKによるリン酸化部位はFGリピートドメインに集中していた。そこでimportin-βに対するpull-downアッセイを行ったところ、ERKでリン酸化されたNup50ではimportin-βとの結合が減弱することが判明した。従ってimportin-α/β依存的な核内輸送がERKによるヌクレオポリンのリン酸化で制御される可能性が示唆された。

The purpose of this study is to develop and clarify a new method for the analysis of intracellular ERK and ROCK in order to determine the identity of intracellular matrix groups. The IMAC technology was successfully applied to the determination of 33 kinds of organic compounds by using the 2D-DIGE technology. This year, we have focused on the development of new ERK matrix, including the components of nuclear pore complex (NMPCs), and the physiological significance of Nup50 and CDIC2. GST-fusion protein was purified by Nup50-CDIC2, and the active ERK2 protein was analyzed by ESI-IT mass analyzer. The activity of ERK in cells depends on the activity of Nup50 and CDIC2. Nup50 contains N-terminal (importin-α binding), central (importin-β binding), C-terminal (Ran binding), and ERK (ERK binding) sites. The pull-down behavior of the importin-β pair was determined by the presence of ERK in the Nup50 importin-β combination. The possibility of inhibition of intracellular transport of β-importin-α/β-dependent ERK is suggested.

项目成果

2D DIGE技術を用いたリン酸化プロテオーム解析によるシグナル伝達経路構成因子の網羅的同定法

利用2D DIGE技术进行磷酸化蛋白质组分析的信号转导通路成分综合鉴定方法

• 发表时间: 2004
• 期刊: 実験医学 22(9)
• 作者: 小迫英尊;牛山正人;服部成介
• 通讯作者: 服部成介

Proteomic identification of Bcl2-associated athanogene 2 as a novel MAPK-activated protein kinase 2 substrate

Bcl2 相关的 athanogene 2 作为新型 MAPK 激活蛋白激酶 2 底物的蛋白质组学鉴定

• 发表时间: 2004
• 期刊: J Biol Chem. 279(40)
• 作者: Ueda K;Kosako H;et al.
• 通讯作者: et al.